Определение антиоксидантной активности меда методом хемилюминесценции. Рациональное питание, пищевые добавки и биостимуляторы. Текст научной работы на тему «Хемилюминесцентная методика определения общей антиоксидантной емкости в лекарственном растительном
дипломная работа
1.4 Методы исследования антиоксидантов
антиоксидантной активности классифицируются: по способам регистрации проявляемой АОА (волюмометрические, фотометрические, хемилюминесцентные, флуоресцентные, электрохимические); по типу источника окисления; по типу окисляемого соединения; по способу измерения окисленного соединения.
Однако наиболее известными методами определения антиоксидантной активности являются:
1 TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity): метод основан на следующей реакции:
Метмиоглобин + Н 2 О 2 >Феррилглобин +ABTS>ABTS*+АО.
Метод определения эквивалентов Тролокса (TEAC) основан на способности антиоксидантов восстанавливать радикальные катионы 2,2-азинобиса (ABTS) и тем самым ингибировать поглощение в длинноволновой части спектра (600 нм). Существенным недостатком метода является двухступенчатая реакция получения радикала. Это удлиняет время проведения анализа и может увеличить разброс результатов, несмотря на то, что для анализа используют стандартизированный набор реактивов .
2 FRAP (ferric reducing antioxidant power): метод основан на следующей реакции:
Fe(III)-Трипиридитриазин+АО>Fe(II)-Трипиридилтриазин.
Железовосстанавливающая/антиоксидантная способность (FRAP). Здесь используется реакция восстановления Fe(III)-трипиридилтриазина до Fe(II)-трипиридилтриазина . Однако этим методом невозможно определение некоторых антиоксидантов, например глутатиона. Этот метод позволяет прямое определение низкомолекулярных антиоксидантов. При низких рН восстановление Fe(III)-трипиридилтриазинового комплекса в Fe(II)-комплекс сопровождается появлением интенсивно голубой окраски. Измерения основаны на способности антиоксидантов подавлять окислительный эффект реакционных частиц, генерируемых в реакционной смеси. Этот метод отличается простотой, быстротой и небольшими затратами при исполнении.
3 ORAC (oxygen radical absorbance capacity): метод основан на следующей реакции:
Fe(II)+H 2 O 2 >Fe(III) + OH*+AO>OH* + Люминол.
Определение способности абсорбировать кислородные радикалы (ORAC). В этом методе регистрируют флуоресценцию субстрата (фикоэритрина или флуоресцеина), которая возникает в результате его взаимодействия с АФК. Если в исследуемом образце есть антиоксиданты, то наблюдают уменьшение флуоресценции по сравнению с контрольным образцом . Первоначально этот метод был разработан доктором Гохуа Као в Национальном институте старения в 1992 г. В 1996 году доктор Као объединился с доктором Рональдом Прайером в совместную группу в Исследовательском центре старения USDA, где был создан полуавтоматический метод .
4 TRAP (total radical trapping antioxidant parameter) : метод основан на следующей реакции:
AAPH+AO>AAPH* + ФЛ (ФЭ).
В этом методе используют способность антиоксидантов взаимодействовать с пероксильным радикалом 2,2- азобис(2-амидинопропан) дигидрохлорид (ААРН). Модификации TRAP состоят в способах регистрации аналитического сигнала. Чаще всего на завершающей стадии анализа перокси-радикал ААРН взаимодействует с люминисцирующим (люминол), флуоресцирующим (дихлорфлюоресцин-диацетат, DCFH-DA) или другим оптически активным субстратом.
В качестве стандарта для методов TEAC, ORAC и TRAP используют водорастворимое производное витамина Е - Trolox (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбокси кислоту).
В последнее время для оценки антиоксидантной активности возрос интерес к применению электрохимических методов. Эти методы обладают высокой чувствительностью, быстротой анализа.
Оценку антиоксидантной активности некоторых пищевых продуктов проводят методом потенциометрии, основанном на использование свойства веществ-антиоксидантов участвовать в окислительно-восстановительных реакциях за счет енольных (-ОН) и сульфгидрильных (-SH) групп.
Определение антиоксидантных свойств растворов основано на химическом взаимодействии антиоксидантов с медиаторной системой, которое приводит к изменению ее окислительно-восстановительного потенциала. Электрохимическая ячейка представляет собой емкость, содержащую K-Na-фостфатный буферный раствор, медиаторную систему Fe(III)/Fe(II) и комплексный электрод до измерения окислительно-восстановительного потенциала. Антиоксидантную активность оценивают в г-экв/л.
Амперометрический метод определения антиоксидантной активности основан на измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества на поверхности рабочего электрода, находящегося под определенным потенциалом. Чувствительность амперометрического способа определяется как природой рабочего электрода, так и потенциалом, приложенном к нему. Предел обнаружения амперометрического детектора полифенолов, флавоноидов на уровне нано-пикограммов,при таких малых концентрациях меньшая вероятность взаимного влияния разных антиоксидантов при их совместном присутствии, в частности проявление явления синергизма. К недостаткам способа можно отнести его специфичность: в данных условиях не могут быть проанализированы антиоксиданты, которые сами окисляются или восстанавливаются в области потенциалов электровосстановления кислорода. К достоинствам способа можно отнести его экспрессность, простату и чувствительность .
Метод гальваностатической кулонометрии с помощью электрогенерированных окислителей - метод применим для анализа жирорастворимых антиоксидантов .
Разработаны различные способы определения аскорбиновой кислоты:
амперометрический способ с использованием алюминиевого электрода, модифицированного пленкой гексацианоферрата никеля (II), методом простого погружения в раствор;
способ твердофазно-спектрофотометрического и визуального тест-определения аскорбиновой кислоты с использованием в качестве индикаторного порошка ксерогеля кремниевой кислоты, модифицированного реактивом Вавеле и медью (II);
хемилюминесцентное определение аскорбиновой кислоты можно провести проточно-инжекционным методом по хемилюминесцентной реакции родамина В с церием (IV) в сернокислой среде .
определение аскорбиновой кислоты в диапазоне 10 -8 -10 -3 г/см 3 методом анодной вольтамперометрии в водных и водно-органических средах.
Наиболее распространенным является метод FRAP, так как он экспрессен, высокочувствителен. За последние несколько десятилетий было разработано большое количество разновидностей методик определения антиоксидантной активности методом FRAP(таблица 1).
Таблица 1 Развитие метода FRAP и его применение для определения антиоксидантной активности разных объектов
|
Объекты анализа |
Примечания |
|||||
|
Плазма крови |
t=4мин. Изучены стехиометрия реакции и аддитивность. |
|||||
|
Чай, вино |
Определение АОА, обусловленной полифенолами |
|||||
|
Сопоставлены значения АОА разных сортов чая |
||||||
|
Pulido,Bravo,Saura-Calixto |
Модель-ные растворы |
t=30мин. Выявлено влияние неводного растворителя |
||||
|
Растения |
||||||
|
Кровь, ткани |
Метод ПИА. Проверено влияние посторонних веществ. |
|||||
|
Firuzi,Lacanna, Petrucci e.a. |
Модель-ные растворы |
Изучена чувствительность определения разных АО как функция их структуры и редокс-потенциала. |
||||
|
Katalinic, Milos, |
Разные вина |
|||||
|
Темердашев, Цюпко и др. |
Модель-ные смеси |
|||||
|
Логинова, Коновалова |
Лекарств. Препара-ты |
Тест-метод |
||||
|
Темердашев, Цюпко и др. |
Красные сухие вина |
Корреляция АОА с другими показателями качества вин |
||||
|
Продолжение таблицы 1 |
||||||
|
Модель-ные смеси |
Изучена чувствительность определения разных АО |
|||||
|
Вершинин, Власова, Цюпко |
Модель-ные смеси |
Выявлена неаддитивность сигнала при недостатке окислителя |
||||
|
Анисимович, Дейнека и др. |
Модель-ные растворы |
Предложены кинетические параметры оценки АОА. |
Примечания: условно обозначено: ПИА-проточно-инжекционный анализ, TPTZ-трипиридилтриазин, DIP-2,2 , -дипиридил, PHEN-о-фенантролин, DPA-пиридиндикарбоновая кислота, FZ-феррозин, АК-аскорбиновая кислота, КТ-катехол, t-время экспозиции, мин.
Взаимодействие между белками и полиэлектролитами в водных растворах
Для характеристики белок-полиэлктролитных комплексов используют различные методы анализа. Инструментальные методы дают информацию по структурным и оптическим свойствам, а также определяют динамику и характер связывания ПЭК...
Влияние соединений d-металлов на скорость диссоциации молекулы воды в биполярной мембране
В процессе синтеза новых БПМ большое внимание должно быть уделено исследованию свойств полученных образцов для последующего выбора условий синтеза, обеспечивающих улучшение электрохимических характеристик синтезируемых мембран...
Дизайнерские наркотики и синтетические каннабиноиды
Обнаружение синтетических каннабиноидов в растительных смесях может быть осуществлено различными физико-химическими методами, такими как хромато-масс-спектрометрия, газовая, тонкослойная и высокоэффективная жидкостная хроматографии...
Разработка методики определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье
Синтез и фармакологические свойства хинолинонов-2
Объект исследования: Хинолинон-2. Метод исследования: С помощью компьютерной программы «Marvin JS», была создана структура вещества. Далее она была отправлена сайт «http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php» для дальнейшего исследования...
Термоспектральный метод исследования продуктов испарения эпоксидного полимера
Технология получения высокоочищенного хитозана из панцирей ракообразных
Определение молекулярной массы хитозана Молекулярную массу хитозана определяли вискозиметрически по стандартной методике. Растворы концентрации 0,05 и 0,5 г/дл готовили растворением навески порошка полимера в ацетатном буфере (0...
Физико-географическая характеристика территории природного парка
1 Милентьев В.Н. 2 Санников Д.П. 3 Казьмин В.М. 21 ФГБОУ ВПО «Орловский государственный институт экономики и торговли»
2 ФГБУ «Центр химизации и сельскохозяйственной радиологии «Орловский»
3 ФГБОУ ВПО «Государственный университет – учебно-научно-производственный комплекс»
Исследована возможность использования хемилюминесценции для оценки антиоксидантной активности пищевых веществ. Предлагаемый способ основан на хемилюминесценции люминола в щелочной среде, интенсивность которой зависит от количества пероксидов в хемилюминесцентной пробе. Хемилюминесценцию регистрировали с помощью разработанной установки, содержащей насос-дозатор, светонепроницаемую камеру, стеклянный вакуумный фотоумножитель, компьютерную систему. Для усиления хемилюминесценции к люминолу добавляли раствор железосинеродистого калия. Изменения интенсивности хемилюминесценции фиксировали в момент введения анализируемой пробы в раствор люминола. В качестве анализируемой пробы использовали экстракт одуванчика, полученный путем сухой низкотемпературной перегонки. В его состав входят фенольные соединения, известные своей высокой антиоксидантной активностью. Установлено, что метод хемилюминесценции может быть использован для определения антиоксидантных свойств различных пищевых соединений.
хемилюминесценция
антиоксидантная активность
пероксиды
пищевые вещества
1. Васильев Р.Ф. Химическое свечение // Химия и химики, 21.01.10. – URL: http://chemistry-chemists.com. (дата обращения: 22.08.13).
2. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты // Вестн. РАМН. – 1998. – № 7. – С. 43–51.
3. Кондрашова Е.А. Хемилюминесценция как наиболее чувствительный метод иммуноферментного анализа и его применение // Клиническая лабораторная диагностика. – 1999. – № 9. – С. 32.
4. Любимов, Г.Ю. Хемилюминесцентный анализ // Иммунология. – 1991. – № 1. – С. 40–49.
5. Маянский А.Н., Невмятуллин А.Л., Чеботарь И.В. Реактивная хемилюминесценция в системе фагоцитоза // Микробиология. – 1987. – № 1. – С. 109–115.
6. Шерстнев М.П. Кальцийзависимый и кальцийнезависимый пути генерации хемилюминесценции клеток // Вопросы хемилюминесценции. – 1991. – № 2. – С. 1–4.
На сегодняшний день хемилюминесценция представляет большую область науки, находящуюся на стыке между химией, физикой и биологией. При хемилюминесценции происходит прямое преобразование химической энергии в энергию электромагнитных колебаний, т.е. в свет. Используя хемилюминесценцию, можно узнать о том, как протекает реакция, каков ее механизм, что необходимо для эффективного и рационального проведения технологических процессов. Если технологический процесс получения какого-либо химического продукта сопровождается хемилюминесценцией, то ее интенсивность может служить мерой скорости процесса: чем быстрее идет реакция, тем ярче свечение. В ходе реакции хемилюминесценции получаются богатые энергией продукты, которые затем отдают энергию, излучая свет, т. е. химическая энергия превращается в энергию электромагнитного излучения .
Цель исследования - изучить возможность использования хемилюминесценции для оценки антиоксидантной активности пищевых веществ.
Результаты исследования и их обсуждение
Проблема оценки антиоксидантной активности пищевых веществ является весьма актуальной. Использование термина «антиоксидантная активность» для того, чтобы показать полезность того или иного продукта, зачастую делается без всякой химической и биохимической аргументации. Как правило, под антиоксидантной активностью любого вещества подразумевается эффективность снижения величины перекисного числа. Само же понятие перекисного числа также не совсем раскрывает свою химическую суть, поскольку не вполне соответствует кинетике и термодинамике стадий метаболизма того или иного пищевого продукта. К тому же эта величина используется для характеристики липидов в форме жиров . Однако процессы окисления и формирования перекисей в организме происходят не только при употреблении жиров, но и других продуктов. Другими словами, содержание перекиси в том или ином продукте можно сказать «взвешивается» на своеобразных весах, где «эталонным весом» является единица концентрации в кислой среде иодид иона, окисленного перекисями, вследствие чего образуется молекулярный иод:
I- - е → I; (1)
I + I → I20. (2)
При титровании молекулярного иода раствором, содержащим тиосульфат натрия, устанавливается его концентрация и, следовательно, определяется количество окислителей иодид ионов, т.е. перекисных соединений, что собственно и называется перекисным числом . Определение перекисного числа с помощью такого рода «взвешивания» основано на реакции, приведенной на рис. 1.
Рис. 1. Определение перекисного числа с помощью тиосульфата натрия
Таким образом, концентрация пероксидов определяется из уравнения
С(I2) = ϒ(C[-O-O-]), (3)
где ϒ - коэффициент корреляции между концентрацией молекулярного иода и концентрацией пероксидов.
Предлагаемый нами способ определения пероксидов в продуктах основан на хемилюминесценции люминола (C[лм]) в щелочной среде, интенсивность (Iхл) которой зависит от концентрации пероксидов (C[-O-O-]), в хемилюминесцентной пробе :
IХЛ. = Ϧхл ω, (4)
где Ϧхл - квантовый выход хемилюминесценции; ω - скорость реакции с участием пероксидов:
kхлC[-O-O-] C[лм] = ω, (5)
где kхл - константа скорости реакции или при:
C[лм] kхл Ϧхл = К, (6)
IХЛ = К C[ -O-O- ]. (7).
Количество пероксидов (-O-O-) определяется светосуммой (S):
Величина S зависит от степени полноты расходования перекиси в хемилюминесцентной реакции.
Для определения константы К строится калибровочная кривая зависимости светосуммы S от концентрации перекиси, которую устанавливают титрованием:
S = f(С[-O-O-]). (9)
В качестве пероксидов используется перекись водорода Н2О2.
Затем сравниваются данные, полученные из уравнения (3) и (9). На основании сравнения ϒ и К делается вывод о согласовании механизмов реакций, лежащих в основе определения пероксидов указанными способами. Выявлено, что в этом интервале концентраций пероксидов ϒ и К действительно согласуются друг с другом и поэтому их можно использовать для определения перекисного числа .
Хемилюминесценцию наблюдали в щелочной среде, содержащей люминол (5-амино-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-фталазиндион, гидразид 3-аминофталевой к-ты, H2L). Регистрировали ее с помощью хемилюминесцентной установки, включающей стеклянный вакуумный фотоумножитель. Питание фотоумножителя осуществляется с помощью высоковольтного выпрямителя (7), сопряженного с блоком (9), усиливающим сигнал фотоумножителя, который регистрируется на дисплее монитора компьютера (5).
Рис. 2. Регистрация хемилюминесценции анализируемого продукта: 1 - насос-дозатор; 2 - светонепроницаемая камера; 3 - зеркало; 4 - кювета; 5 - компьютерная система; 6 - фотоумножитель; 7 - высоковольтный выпрямитель; 8 - устройство, позволяющее определять спектральную область хеминилюминесцентного излучения; 9 - блок, усиливающий сигнал фотоумножителя
Насос-дозатор (1) необходим для ввода анализируемой пробы в кювету (4), содержащую хемилюминисцирующий раствор люминола. Данный дозатор выполняет роль перемешивателя вводимой пробы с хемилюминесцирующим раствором. Для усиления скорости реакции и интенсивности хемилюминесценции к люминолу добавляли раствор железосинеродистого калия. Перемешивание производится пузырьками воздуха, полученными при прокачивании насосом воздуха через жидкость раствора. Зеркало (3), находящееся в светонепроницаемой камере (2), служит для лучшего светосбора хемилюминесцентного излучения, падающего на фотокатод фотоумножителя (6), вмонтированного в светонепроницаемую камеру. Дозатор позволяет вводить нужные компоненты жидкости в кювету, не открывая светонепроницаемой камеры (2) во время опытов. При этом указанные жидкости поступают в кювету (4) по стеклянным либо пластмассовым трубкам. Компьютерная система позволяет регистрировать зависимость интенсивности свечения I от времени t, то есть кинетику хеминилюмисценции:
Компьютерная система отражает константы нарастания и спада в функции I = f(t), которые сопрягаются с константами скоростей реакций, обуславливающих хемилюминесценцию, то есть с их кинетиками . В хемилюминесцентную камеру включается устройство (8), позволяющее определять спектральную область хемилюминесцентного излучения, то есть зависимость:
I = f1(λ). (11)
Этот блок представляет собой кассету в виде диска, в которую вмонтированы граничные светофильтры. Смена светофильтров осуществляется поворотом кассеты диска относительно горизонтальной оси, соединяющей центры плоскости светофильтров и плоскости фотокатода фотоумножителя.
Процесс измерения осуществляется следующим образом:
1. Устанавливается реакция фотоумножителя на изменения напряжения его питания и на изменение интенсивности эталонного источника света, который падает на его катод.
2. Производится заполнение кюветы раствором люминола в щелочной среде.
3. Осуществляется заполнение дозатора анализируемой пробой.
4. Регистрируется зависимость интенсивности хемилюминесценции от времени t. Наблюдения за хемилюминесценцией осуществляется до момента времени t1, при котором изменение I1 от времени t минимально: I1 = f1(t).
5. Подается с помощью дозатора порция анализируемого раствора.
6. Наблюдается хемилюминесценция анализируемой пробы, кинетика которой I = f(t).
На рис. 3 представлен график зависимости функций (I1 = f1(t)), сопряженный с графиком (I = f(t)), после введения анализируемого раствора.
Как видно из рис. 3, интенсивность хемилюминесценции люминола меняется: за резким подъемом следует резкий спад свечения после добавления анализируемой пробы.
Поскольку усиление хемилюминесценции при окислении люминола связано с образованием пероксидов, то снижение интенсивности хемилюминесценции после введения анализируемой пробы свидетельствует об уменьшении их количества . Следовательно, можно говорить о наличии антиоксидантной активности у соединений, входящих в состав анализируемой пробы.
Необходимо отметить, что в качестве анализируемой пробы использовался полученный путем сухой низкотемпературной перегонки экстракт одуванчика, в состав которого входят фенольные соединения, известные своей высокой антиоксидантной активностью.
Рис. 3. График зависимости функций (I1 = f1(t)), сопряженный с графиком (I = f(t)), после введения анализируемого раствора
Кроме того, в ходе эксперимента установлено, что при помощи хемилюминесценции можно определять количество пероксидов в сверхразбавленных системах, что важно для оценки начала окисления продуктов, например, в процессе их хранения .
Таким образом, проведенные исследования показали, что способ определения пероксидов в продуктах, основанный на хемилюминесценции люминола в щелочной среде, позволяет оценить антиоксидантную активность пищевых веществ и может быть использован для установления антиоксидантных свойств различных пищевых соединений.
Рецензенты:
Литвинова Е.В., д.т.н., профессор кафедры технологии, организации и гигиены питания, ФГБОУ ВПО «ОрелГИЭТ», г. Орел;
Ковалева О.А., д.б.н., директор ИНИИЦ, ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет», г. Орел.
Работа поступила в редакцию 08.11.2013.
Библиографическая ссылка
Паничкин А.В., Большакова Л.С., Милентьев В.Н., Санников Д.П., Казьмин В.М. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ ПИЩЕВЫХ ВЕЩЕСТВ // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 10-11. – С. 2436-2439;URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32810 (дата обращения: 17.12.2019). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
Нажав на кнопку "Скачать архив", вы скачаете нужный вам файл совершенно бесплатно.
Перед скачиванием данного файла вспомните о тех хороших рефератах, контрольных, курсовых, дипломных работах, статьях и других документах, которые лежат невостребованными в вашем компьютере. Это ваш труд, он должен участвовать в развитии общества и приносить пользу людям. Найдите эти работы и отправьте в базу знаний.
Мы и все студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будем вам очень благодарны.
Чтобы скачать архив с документом, в поле, расположенное ниже, впишите пятизначное число и нажмите кнопку "Скачать архив"
Подобные документы
Исследование ферментативных и неферментативных путей образования активных форм кислорода. Механизмы их повреждающего воздействия на живые клетки, в частности, инициация свободнорадикального перекисного окисления липидов. Антиоксидантная защита организма.
курсовая работа , добавлен 11.01.2017
Антиоксидантная активность растительных материалов. Описание растений, обладающих антиоксидантной активностью. Определение содержания витамина С в калине обыкновенной в период созревания, содержания полифенольных соединений в различных сортах чая.
дипломная работа , добавлен 02.04.2009
Гиббереллины - обширный класс фитогормонов, регулирующих рост и развитие: история открытия, химическая структура, классификация, содержание в растениях. Биохимия, регуляторные функции и биологическая активность гиббереллинов, их строение, свойства.
презентация , добавлен 20.10.2014
реферат , добавлен 19.05.2017
Биологическая активность и химическая структура брассиностероидов. Синтезы с сохранением углеродного скелета. Формирование функций характерных для циклической части брассиностероидов. Построение боковой цепи с образованием новых углерод-углеродных связей.
курсовая работа , добавлен 07.12.2014
Исследование физиологии поджелудочной железы, роли панкреатического сока в процессе пищеварения. Анализ активных форм кислорода и путей их образования, биохимии свободно-радикальных процессов. Обзор состояния обменных процессов при остром панкреатите.
курсовая работа , добавлен 10.03.2012
Химический состав рода Penstemon и биологическая активность. Качественный фитохимический анализ растительного сырья методом тонкослойной хроматографии. Определение количественного состава компонентов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
практическая работа , добавлен 07.01.2016
АнтиОксиданты (АО) - вещества, препятствующие окислению. В живом организме ведущим фактором окисления является образование свободных радикалов, поэтому действие антиоксидантов в биологических системах рассматривается преимущественно с позиции предотвращения окисления органических веществ свободными радикалами.
В настоящее время существует большое количество различных методов определения антиоксидантов: фотометрические, химические, электрохимические и др. Однако, многие из них имеют существенные недостатки, затрудняющие понимание и дальнейшее использование результатов, полученных этими методами. К наиболее часто встречающимся недостаткам можно отнести следующие:
- Используются искусственные или нехарактерные для биологических систем условия измерения антиоксидантного действия. Например, вместо биологических свободно-радикальных реакций используются чисто химические окислительно-восстановительные реакции или осуществляется измерение способности вещества отдавать/принимать электроны при воздействии электрическим током. Результаты измерений, полученные в таких условиях, не позволяют говорить о том, исследуемое вещество будет проявлять такое же "антиоксидантное" действие в организме.
- Определение антиоксидантного действия осуществляется путем измерения количества накопленных продуктов окисления (маркеров окисления). Таким образом действительно можно определить количество антиоксиданта в исследуемом образце, но упускается весьма важная информация об активности антиоксиданта. Игнорирование активности антиоксиданта в свою очередь может приводить к существенным ошибкам в определении его количества, например, для "слабых" антиоксидантов, которые действуют медленно, но в течение длительного времени.
Хемилюминесцентный метод является наиболее информативным методом исследования антиоксидантов и обладает рядом существенных преимуществ:
- Прямое определение антиоксидантного действия
- регистрируется непосредственное действие антиоксидантов на свободные радикалы.
В хемилюминесцентном методе используется химическая система генерации свободных радикалов, которая дает контрольное хемилюминесцентное свечение.
Затем к такой системе добавляется антиоксидант, который нейтрализует свободные радикалы, что приводит к подавлению контрольной хемилюминесценции.
Значительным достоинством такого подхода является возможность использования различных химических систем генерации свободных радикалов, что позволяет дополнительно определять специфичность антиоксидантов и локализацию их действия. - Измерение количественных и качественных характеристик антиоксидантов
- хемилюминесцентный метод позволяет охарактеризовать
любое соединение, обладающее антиоксидантным действием, двумя независимыми показателями:
- АнтиОксидантная Емкость (АОE) - общее количество свободных радикалов, которое может нейтрализовать соединение, содержащееся в пробе определенного объема.
- АнтиОксидантная Активность (АОА) - скорость нейтрализации свободных радикалов, т.е. количество радикалов, нейтрализуемых в единицу времени.
Хемилюминесцентный метод
дает важное понимание того,
что действие антиоксидантов обязательно должно оцениваться двумя показателями - количественным (AOE) и качественным (AOA).
Следующий рисунок демонстрирует это положение:
Влияние разных антиоксидантов на хемилюминесценцию
(цифрами возле графиков указана концентрация антиоксиданта):
слева – "сильный" антиоксидант, справа – "слабый" антиоксидант.
Антиоксиданты существенно отличаются своей активностью. Существуют "сильные" антиоксиданты, т.е. антиоксиданты с высокой активностью, которые ингибируют свободные радикалы с высокой скоростью и полностью подавляют хемилюминесценцию. Такие антиоксиданты оказывают максимальный эффект уже при малых концентрациях и быстро расходуются. С другой стороны существуют "слабые" антиоксиданты, т.е. антиоксиданты с низкой активностью, которые ингибируют свободные радикалы с низкой скоростью и подавляют хемилюминесценцию лишь частично. Значимый эффект такие антиоксиданты оказывают только в больших концентрациях, но при этом они медленно расходуются и действуют в течение длительного времени.
Хемилюминесцентный метод может применяться для определения антиоксидантных показателей:
- биологических жидкостей (плазма, слюна, моча);
- фармакологических препаратов и биологически активных добавок;
- напитков и пищевых добавок;
- косметических средств и средств для ухода;
- и др.
- Хемилюминометр Lum-100 - обеспечивает термостатирование и регистрацию хемилюминесценции 1 пробы.
- Хемилюминометр Lum-1200 - обеспечивает термостатирование и одновременную регистрацию хемилюминесценции до 12 проб.
], однако определение антиоксидантов как химических соединений не дает полного представления о защитных свойствах изучаемого объекта: они обусловливаются не только количеством того или иного антиоксиданта, но также активностью каждого из них. Активность антиоксиданта, или антиоксидантная активность, АОА, - это константа скорости реакции антиоксиданта со свободным радикалом (kInH). Метод хемилюминесценции (ХЛ) позволяет определять общее количество радикалов, которое связывают антиоксиданты в образце (общую антиоксидантную емкость, ОАЕ), а при использовании метода математического моделирования кинетики ХЛ - также скорость образования и реакции радикалов с антиоксидантами, то есть АОА [ , , ].
Наиболее распространенная модификация хемилюминесцентного метода определения общей антиоксидантной емкости основана на применении люминола в качестве активатора хемилюминесценции [ , , , ]. В кювету хемилюминометра помещают образец с добавлением люминола, пероксида водорода и соединения, способного образовывать радикалы в результате спонтанного распада (термолиза), например 2,2’-азобис-(2-амидинопропан) дигидрохлорида (АБАП): АБАП → 2R . В присутствии молекулярного кислорода алкильный радикал R образует пероксильный радикал ROO : R + O 2 → ROO . Далее пероксильный радикал окисляет хемилюминесцентный зонд люминол (LH 2), и образуется радикал люминола (LH ): ROO + LH 2 → ROOH + LH . Из LH через образование промежуточных веществ (гидропероксида люминола и эндопероксида люминола) образуется молекула конечного продукта окисления люминола, аминофталевой кислоты, в электронно-возбужденном состоянии, которая высвечивает фотон, и в результате наблюдается хемилюминесценция . Интенсивность ХЛ пропорциональна скорости образования фотонов, а она, в свою очередь, пропорциональна стационарной концентрации LH в системе. Взаимодействуя с радикалами, антиоксиданты прерывают описанную цепочку превращений и препятствуют образованию фотона.
Соединения, подверженные термолизу, - не единственный возможный источник радикалов при анализе антиоксидантной емкости образца хемилюминесцентным методом. Альтернативами являются системы пероксидаза хрена–перекись водорода [ , ], гемин–пероксид водорода , цитохром с –кардиолипин–пероксид водорода и др. Схема реакций окисления люминола пероксидазами рассмотрена в работе Cormier и соавт. .
Кинетические кривые ХЛ для этих систем отражают две стадии реакции: стадию увеличения интенсивности ХЛ и стадию плато или постепенного спада свечения, когда интенсивность ХЛ либо постоянна, либо медленно снижается. В работе описаны два подхода к измерению общей антиоксидантной емкости, учитывающие эту особенность кривых. Метод TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) основан на измерении латентного периода ХЛ τ и может быть использован для определения таких антиоксидантов, как тролокс или аскорбиновая кислота: они характеризуются высоким значением константы скорости реакции с радикалами и по этой причине могут быть названы сильными антиоксидантами . В течение латентного периода происходит их полное окисление. Методом TAR (Total Antioxidant Reactivity) измеряют степень тушения хемилюминесценции q на плато или в максимуме хемилюминесцентной кривой: формула , где I - интенсивность хемилюминесценции без антиоксиданта, а I 1 - интенсивность ХЛ в присутствии антиоксиданта. Этот метод используется, если в системе присутствуют преимущественно слабые антиоксиданты с низкими константами скорости взаимодействия с радикалами - намного более низкими в сравнении с константой люминола .
Действие антиоксидантов характеризуют не только показателями τ и q . Как видно из работ [ , ], действие таких антиоксидантов, как мочевая кислота в системе гемин–H 2 O 2 –люминол или токоферол, рутин и кверцетин в системе цитохром с –кардиолипин–H 2 O 2 –люминол, характеризуется изменением максимальной скорости нарастания ХЛ (v max ). Как показывают результаты математического моделирования кинетики, значения констант скорости взаимодействия этих антиоксидантов с радикалами близки к значению константы люминола, поэтому такие антиоксиданты могут быть названы антиоксидантами средней силы .
Если бы изучаемый материал, в частности растительное сырье, содержал только один тип антиоксидантов, то их содержание можно было бы характеризовать одним из трех перечисленных выше показателей (τ , q или v max ). Но в растительном сырье содержится смесь антиоксидантов разной силы. Чтобы решить эту проблему, некоторые авторы [ , , , ] использовали изменение светосуммы хемилюминесценции за определенное время ∆S, рассчитанное по формуле , где ∆S 0 и ∆S S - светосуммы ХЛ за заданное время t в контрольном и исследуемом образцах соответственно. Время должно быть достаточным для окисления всех антиоксидантов в системе, то есть для выхода кривой ХЛ исследуемого образца на уровень кривой ХЛ контрольного образца. Последнее предполагает, что исследователи должны не только регистрировать светосумму свечения, но и записывать кривую кинетики ХЛ в течение достаточно длительного времени, что делают далеко не всегда.
Поскольку все измеряемые показатели зависят от прибора и условий измерения, антиоксидантный эффект вещества в исследуемой системе обычно сравнивают с эффектом антиоксиданта, принятого за стандарт, например тролокса [ , ].
Система пероксидаза хрена–пероксид водорода применялась для анализа общей антиоксидантной емкости растительного сырья многими авторами. В работах [ , ] для оценки количества антиоксидантов в образцах использовали латентный период ХЛ (метод TRAP), а в работах [ , , ] - площадь под кривой развития ХЛ. Однако в перечисленных работах не дано четкого обоснования выбора того или иного параметра для оценки ОАЕ.
Целью исследования было определить, как соотношение антиоксидантов различного типа влияет на ОАЕ, и модифицировать метод хемилюминесценции таким образом, чтобы иметь возможность точнее определять ОАЕ в растительном сырье. Для этого мы поставили перед собой несколько задач. Во-первых, сравнить кинетику ХЛ исследуемых объектов с кинетикой стандартных антиоксидантов трех типов (сильного, среднего и слабого), чтобы понять, антиоксиданты какого типа вносят основной вклад в ОАЕ исследуемых объектов. Во-вторых, рассчитать ОАЕ исследуемых объектов, измерив уменьшение светосуммы ХЛ под действием этих объектов в сравнении с действием антиоксиданта, обеспечивающего наибольший вклад в ОАЕ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования были промышленные образцы плодов боярышника, рябины и шиповника производства АО «Красногорсклексредства» (Россия), а также плоды малины, собранные авторами на территории Московской области в условиях естественного произрастания и высушенные при температуре 60–80 °С до прекращения выделения ими сока и деформации при надавливании.
Реактивами для анализа антиоксидантной емкости хемилюминесцентным методом служили: КH 2 PO 4 , 20 мМ буферный раствор (рН 7,4); пероксидаза из корней хрена (активность 112 ед./мг, М = 44 173,9), 1 мМ водный раствор; люминол (5-амино-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-фталазиндион, гидразид 3-аминофталевой кислоты, М = 177,11), 1 мМ водный раствор; пероксид водорода (Н 2 О 2 , М = 34,01), 1 мМ водный раствор; растворы антиоксидантов (аскорбиновой кислоты, кверцетина, токоферола). Все реагенты - производства фирмы Sigma Aldrich (США).
Отвары плодов боярышника, рябины и шиповника и настой плодов малины готовили по методике Государственной фармакопеи СССР, изложенной в общей фармакопейной статье «Настои и отвары» .
Определение общей антиоксидантной емкости проводили путем регистрации хемилюминесценции на хемилюминометре Lum-100 («ДИСофт», Россия) с использованием программного обеспечения PowerGraph 3.3. Для определения ОАЕ в растительном сырье в кювету прибора помещали 40 мкл люминола в концентрации 1 мМ, 40 мкл пероксидазы хрена в концентрации 0,1 мкМ, от 10 до 50 мкл отвара или настоя (в зависимости от концентрации) и фосфатный буфер в количестве, необходимом для доведения общего объема пробы до 1 мл. Кювету устанавливали в прибор и регистрировали ХЛ, наблюдая фоновый сигнал. По истечении 48 с регистрации фонового сигнала в кювету вносили 100 мкл Н 2 О 2 в концентрации 1 мМ и продолжали регистрацию ХЛ в течение 10 мин. Готовили по четыре пробы с различной концентрацией каждого из растительных объектов. Регистрировали также ХЛ для растворов аскорбиновой кислоты, кверцетина и токоферола в пяти различных концентрациях для каждого из антиоксидантов. В дальнейшем ОАЕ образцов отваров и настоя пересчитывали на кверцетин.
Концентрации люминола, пероксидазы хрена и перекиси водорода были подобраны так, чтобы определять антиоксидантную емкость водных извлечений из лекарственного растительного сырья за приемлемое время (не более 10 мин). За это время кривые хемилюминесценции для антиоксидантов аскорбата и флавоноида кверцетина (основные антиоксиданты растительного сырья) выходили на плато, что указывало на полное разрушение антиоксидантов в системе. Разведения исследуемых образцов и концентрации растворов стандартных антиоксидантов (указаны в подписях к рисункам) подбирали таким образом, чтобы все кинетические кривые ХЛ были измерены при одной и той же чувствительности прибора.
Антиоксидантную емкость рассчитывали по изменению площади (∆S ) под кинетической кривой хемилюминесценции (светосуммы) при добавлении вещества, содержащего антиоксидант. Для этого подсчитывали S 0 для системы без антиоксиданта и вычитали из нее площадь S S , характеризующую систему, в которую был добавлен антиоксидант. Величина ∆S зависит от чувствительности хемилюминометра и условий измерения. Отношение ∆S/C · V (где C - концентрация исследуемого биологического материала в кювете, г/л, и V - объем кюветы, л) выражает антиоксидантную емкость 1 г изучаемого материала, т. е. растительного сырья.
Аналогичным образом рассчитывали антиоксидантную емкость ∆S A раствора стандартного антиоксиданта, например кверцетина, помещенного в тот же объем реакционной смеси. Отношение ∆S A /C A · V (где C A - весовая концентрация антиоксиданта в кювете, г/л) выражает антиоксидантную емкость 1 г антиоксиданта.
Для каждого из стандартных антиоксидантов регистрировали сигнал от растворов нескольких концентраций, чтобы убедиться в том, что расчеты ведутся в пределах линейной зависимости, а полученные результаты воспроизводимы. Действительно, была получена линейная зависимость (∆S A = k A · C A ) сигнала от концентрации, по которой рассчитали стехиометрический коэффициент k A . По критерию Фишера полученные для стандартных антиоксидантов значения k A статистически значимы с вероятностью 0,975. Далее регистрировали сигнал от четырех концентраций для каждого из четырех растительных образцов, и для всех образцов получили линейную зависимость сигнала от концентрации (∆S = k · C ), по которой рассчитали стехиометрический коэффициент k . С вероятностью 0,975 (критерий Фишера) полученные для растительных образцов значения k статистически значимы. Общую антиоксидантную емкость растительного материала в пересчете на массу стандартного антиоксиданта (мг%) находили по формуле .
Значения были представлены как среднее арифметическое ± среднеквадратическое отклонение (M ± δ) при p
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучение кинетики хемилюминесценции в присутствии аскорбата натрия (Рис. 1. Влияние аскорбата натрия на кинетику хемилюминесценции" data-note="Концентрации компонентов системы: люминол - 40 мкМ, пероксидаза хрена - 4 нМ, пероксид водорода - 100 мкМ. Кривые: 1 - контрольный образец; 2 - 0,05 мкМ; 3 - 0,10 мкМ; 4 - 0,15 мкМ; 5 - 0,2 мкМ; 6 - 0,25 мкМ аскорбата натрия.">рис. 1) показало, что для этого антиоксиданта характерен латентный период, когда ХЛ практически полностью подавлена. Его продолжительность пропорциональна количеству антиоксиданта в системе. При этом не изменяется ни наклон кривых ХЛ, ни интенсивность ХЛ на плато. Это объясняется тем, что аскорбиновая кислота - сильный антиоксидант, перехватывающий все радикалы, образующиеся в системе, в том числе радикалы люминола, и ХЛ не развивается до тех пор, пока не окислится весь аскорбат.
Другими исследователями также показано, что результаты химического анализа и значение ОАЕ, определенное хемилюминесцентным методом, часто не совпадают. В работе общая антиоксидантная емкость, определенная в системе пероксидаза–люминол–перекись водорода коррелировала с содержанием тритерпеновых соединений. Однако в работе тех же авторов , в которой объектом исследования было другое растение, не наблюдали корреляции ОАЕ с содержанием какой-либо группы веществ, в том числе флавоноидов.
Подобные расхождения связаны по меньшей мере с тремя факторами. Во-первых, имеет значение активность антиоксидантов, т. е. скорость их взаимодействия с радикалами, которая различна для разных антиоксидантов, входящих в состав растительного образца. По данным Измайлова , константы скорости соответствующих реакций для мексидола, токоферола и кверцетина соотносятся как 0,04: 2: 60. Во-вторых, каждая молекула антиоксиданта, вступая в химическую реакцию, может перехватить различное количество радикалов. По данным работы , кверцетин, мочевая и аскорбиновая кислоты перехватывали 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 и 0,5 ± 0,2 радикалов на одну прореагировавшую молекулу антиоксиданта соответственно (использовалась система гемин–H 2 O 2 –люминол). В-третьих, на результаты исследования могло оказать влияние наличие пероксидазной активности у самих растительных образцов, как в работе , а также наличие в образцах кальция, который, как это показано в работе , способен в определенных условиях повышать активность пероксидазы хрена. Обычно это обусловливает более высокую интенсивность ХЛ на плато, чем на контрольных кривых, чего мы, однако, не наблюдали.
Первый фактор резко ограничивает применение такого параметра, как изменение светосуммы, так как время измерения хемилюминесценции должно быть больше времени расходования всех антиоксидантов в исследуемом образце. О наступлении этого момента можно судить, только измеряя кинетику хемилюминесценции. Кроме того, вклад слабых антиоксидантов в ОАЕ резко занижен, поскольку время их полного окисления во много раз превышает приемлемую продолжительность измерения (10–20 мин).
Еще большее значение имеет стехиометрический коэффициент антиоксиданта. Количество радикалов n , перехватываемое им, равно , где ρ - стехиометрический коэффициент, а ∆m - изменение концентрации антиоксиданта за время измерения, в нашем случае - исходная концентрация исследуемого вещества в опытной пробе.
Разница в светосумме свечения в отсутствие антиоксиданта и в его присутствии пропорциональна n . Суммарное число перехваченных радикалов равно , где ρ i - стехиометрический коэффициент конкретного антиоксиданта, а m i - его концентрация во время измерения. Суммарное число перехваченных радикалов заведомо не равно суммарному количеству антиоксидантов, поскольку коэффициенты ρ i не только не равны единице, но и существенно отличаются для разных антиоксидантов.
Величина n пропорциональна разнице светосумм, измеренных за определенное время между образцом, содержащим антиоксидант, и контрольным образцом, не содержащим антиоксидантов: S = k · n , где k - коэффициент, постоянный при одинаковых условиях измерения.
Рассмотренный в статье метод позволяет определить общую антиоксидантную емкость, тогда как химический анализ позволяет определить суммарное содержание антиоксидантов в продукте. Поэтому метод хемилюминесценции представляется информативнее химических анализов.
Подобранные нами условия оценки общей антиоксидантной емкости растительного сырья методом регистрации кинетики хемилюминесценции в системе, состоящей из пероксидазы хрена, перекиси водорода и люминола (концентрации компонентов - 4 нМ, 100 мкМ и 40 мкМ соответственно; 20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4), обеспечили окисление сильных антиоксидантов (аскорбиновая кислота) и антиоксидантов средней силы (кверцетин) за 10 мин. Такая продолжительность измерения удобна и обеспечивает требуемое качество измерений.
Анализ кинетики хемилюминесценции показал, что в изученных объектах (отварах плодов рябины, шиповника, боярышника и настое плодов малины) основными антиоксидантами являются антиоксиданты средней силы, в том числе флавоноиды, и слабой силы (токоферол и др.). На основе уменьшения светосуммы хемилюминесценции была рассчитана общая антиоксидантная емкость для изученных объектов. Сравнение полученных значений ОАЕ с результатами химического анализа показало, что продукты, содержащие одно и то же количество антиоксидантов с разным их соотношением, могут различаться по своей способности эффективно защищать организм от вредного воздействия свободных радикалов. Описанная методика перспективна для изучения растительных объектов, в которых содержится смесь различных антиоксидантов. При этом она отличается простотой и невысокой стоимостью исследования. Сочетание измерения кинетики хемилюминесценции с математическим моделированием реакций позволит не только автоматизировать процесс определения ОАЕ, но и определять вклад отдельных групп антиоксидантов в показатель.