Идентификация и количественное определение пестицидов в растительных материалах хроматографическими методами остроухова ольга константиновна. Методы определения пестицидов Определение линейно-логарифмических индексов удерживания и относительных оптических

Поиск оптимальных методов анализа пестицидов – одна из важнейших проблем аналитической химии. С современных позиций к ним, в первую очередь, относятся капиллярная газовая хроматография (ГХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ) и капиллярный электрофорез (КЭ). Эти методы обладают высокой разделяющей способностью, необходимой при анализе многокомпонентных образцов, и высокой чувствительностью, позволяющей определять пестициды на уровне концентраций 1 мкг/дм 3 и ниже.

Выбор конкретного метода анализа во многом определяется самой аналитической задачей. К типичным задачам можно отнести следующие:

− определение пестицидов на разных стадиях их производства, приготовления готовых форм, при их хранении;

− определение остаточных количеств пестицидов в сельскохозяйственной продукции, в почве и в природных водах;

− определение пестицидов в биологических образцах;

− определение пестицидов в продуктах питания, в атмосфере, в питьевой воде.

Две последние задачи являются наиболее сложными, так как они требуют одновременного определения не заведомо известных веществ, а набора соединений из всего списка применяемых на практике пестицидов, количество которых превышает 1000 названий. Задачи такого типа иногда называют скриннинговыми. Их решают, главным образом, с помощью метода ГХ с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС), когда идентификация пестицидов осуществляется по заранее созданной библиотеке масс-спектров.

Учитывая большое разнообразие пестицидов при выборе методов их определения предпочтение, очевидно, надо отдавать «универсальным» методикам. Лаборатория, работающая по принципу «для каждого вещества свой метод анализа», может обеспечить высокую производительность лишь только по отношению к относительно малому количеству веществ. Переход от одной группы пестицидов к другой требует больших затрат времени на перестройку и калибровку приборов, приготовление стандартов и пр.

Рассматривая химико-аналитические методы с точки зрения их «универсальности» по отношению к анализу пестицидов, можно сделать следующие замечания.

Метод ТСХ достаточно чувствительный и простой в исполнении, однако в силу своей относительно невысокой разрешающей способности «универсальным»быть не может.

Метод ГХ обладает очень высокой разрешающей способностью, но его применение ограничивается термической лабильностью ряда пестицидов и необходимостью привлекать различные способы химической дериватизации многих пестицидов для повышения их летучести.

Метод капиллярного электрофореза, имея высокую разрешающую способность, не обеспечивает приемлемую концентрационную чувствительность и требует весьма высокую степень концентрирования образца, что часто нельзя осуществить из-за ограниченной растворимости пестицидов.

Метод ВЭЖХ обеспечивает для решения многих задач достаточное разрешение, не требует, как правило, предварительной дериватизации и пригоден для анализа термолабильных пестицидов. В сочетании с ГХ он позволяет решить практически все задачи, и именно эти два метода нашли наибольшее распространение в современной экологической аналитической химии.

Пестициды, как уже говорилось, отнесены к приоритетным экотоксикантам, и поэтому, должны находиться под постоянным контролем в объектах окружающей среды. Мониторинг пестицидов предусматривает их количественное определение в широком интервале концентраций, включающем уровень фона. Среди методов анализа, которые применимы к определению пестицидов, в первую очередь относятся высокоэффективные варианты газовой и жидкостной хроматографии.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) – один из самых информативных аналитических методов. Он широко используется во всех развитых странах, но, по сравнению с другими физико-химическими методами анализа, требует весьма высокой квалификации персонала, а стоимость одного анализа достигает нескольких десятков и даже сотен долларов США. Таким образом, упрощение самой процедуры ВЭЖХ-анализа и снижение ее стоимости предоставляется важной задачей.

Указанные недостатки ВЭЖХ обусловлены тем, что для каждого пестицида (или группы пестицидов) нормативные документы регламентируют свой «уникальный» вариант ВЭЖХ-анализа. Это приводит к необходимости часто перестраивать хроматограф, что занимает много времени и требует определенного опыта. Кроме того, аналитическая лаборатория, выполняющая анализы с привлечением многих разных методик, вынуждена содержать целый склад дорогостоящих колонок, органических растворителей и стандартных образцов пестицидов.

К пестицидам, определяемым в мировой практике методом ВЭЖХ, относятся труднолетучие и термолабильные соединения. К ним относятся атразин, симазин,хлорпрофам, линурон, хлортолурон, алахлор, трифлюоалин.

В анализе пестицидов используются особые методы пробоподготовки, которыепредставляется полезным рассмотреть более подробно.

Жидко-жидкостная экстракция (ЖЖЭ) – классический способ извлечения пестицидов из водных образцов. Обычно проводят повторяющуюся несколько раз экстракцию из 500–1000 мл водного образца в делительной воронке. Наиболее популярным растворителем является дихлорметан. Он способен экстрагировать соединения с различной полярностью и легко упаривается. Методы Агентства по охране окружающей среды США (ЕРА US) 8120 и 8140используют ЖЖЭ с помощью дихлорметана для определения в воде 15 хлорорганических и 21 фосфорорганических пестицидов. Для извлечения гербицидов – производных карбоновых кислот – исходную воду подкисляют до рН<2 и затем экстрагируют неионизованные молекулы диэтиловым эфиром или дихлорметаном.

Классическая ЖЖЭ трудно автоматизируется, требует больших объемов токсичных растворителей и весьма продолжительна по времени. Разделению слоев растворителей при анализе сильно загрязненных вод часто мешает образование устойчивых эмульсий. В таких случаях рекомендуют одиночную длительную ЖЖЭ делительной воронке объемом 1л c растворителем, тяжелее воды.

Хотя классическая ЖЖЭ имеет много недостатков, она продолжает совершенствоваться. Так появилась микроЖЖЭ, разработаная как альтернативный метод для определения гербицида алахлор и двух его метаболитов. Принцип микроЖЖЭ – экстракция из большого объема воды (400 мл) очень маленьким объемом растворителя (500 мкл толуола) – может быть применена в качестве подготовки пробы для анализа методом ГХ без стадии испарения, что важно для определения высоколетучих соединений. В сравнении с твердофазной экстракцией этот метод подготовки пробы быстрее и дешевле.

Большое число разных гербицидов (фенилмочевины, триазины, динитроанилины, хлорацетамиды и урацилы) экстрагируют из пищевых продуктов механическим встряхиванием или гомогенизацией с органическими растворителями, такими как метанол, ацетонитрил, часто смешанными с водой дихлорметаном или этилацетатом, иногда при кислом значении рН.

Высокополярные гербициды, такие как глифосат, нерастворимы в большинстве органических растворителей и их экстрагируют водой или водой с хлороформом, иногда при кислом значении рН. При этой процедуре другие растворимые в воде компоненты (аминокислоты, аминосахара и др.) экстрагируются также. Их присутствие мешает определению глифосатов и делает необходимой очистку экстрактов, которая чаще всего осуществляется на ионообменных хроматографических колонках.

Бипиридиновые пестициды (дикват и паракват – четвертичные аммониевые соединения) обычно экстрагируют из матриц дефлегмацией или нагреванием с серной или с соляной кислотами, после чего проводят твердо-фазную экстракцию и хроматографию.

Твердофазная экстракция (ТФЭ) как метод подготовки образцов известна уже 50 лет. Ее преимущества: экономия времени и растворителей, исключение опасности образования эмульсий, возможность выделения следовых количеств аналита, возможность автоматизации. Особенно часто ТФЭ применяют при анализе природных вод.

ТФЭ активно применяют для определения триазиновых пестицидов и продуктов их распада – гидрокси-s -триазинов, гербицидов – производных мочевины, N -метилкарбаматов и их полярных метаболитов, хлорорганических и фосфорорганических инсектицидов, полярных пестицидов пиретроидов, триазольных и пиримидиновых пестицидов. Разработаны методы ТФЭ многокомпонентных смесей, включающие большое число пестицидов различных классов. Для повышения эффективности экстракции полярных пестицидов иногда применяют колонки со смесью двух сорбентов, например фаз С18 и Фенил.

При ТФЭ кислот на фазах С18 для уменьшения потерь раствор образца целесообразно подкислить до рН<2. Для ТФЭ неионных соединений иногда применяют графитированные сорбенты и фазы, представляющие собой макросетчатые стирол-дивинилбензольные полимеры. Для пестицидов триазиновой группы, производных мочевины и группы феноксикислот успешно используют картриджи с активированной графитированной сажей Carbopack B , ионообменные смолы в ацетатной форме и фазу пропил-NH 2 . Для ТФЭ фосфорорганических пестицидов применяют мембранные диски из полистирол-дивинилбензола типа «XAD ».

Сверхкритическая жидкостная экстракция (СКЖЭ) является относительно новым методом, применяемым для извлечения веществ с помощью специальных экстрагентов – «сверхкритических» жидкостей. Такими экстрагентами могут быть жидкие СО 2 , NH 3 , пропан, бутан и др. Перечисленные газы переходят в жидкое состояние при высоких давлениях, поэтому СКЭЖ проводят в автоклавах. После окончания экстракции давление в автоклавах сбрасывают до атмосферного, газ-экстрагент улетает, и в автоклаве остаются только экстрагированные вещества. Их растворяют в подходящих растворителях и растворы анализируют.

СКЖЭ используется главным образом для анализа различных классов пестицидов в почвах, тканях животных и растений. Регулируют эффективность экстракции путем добавок к экстрагенту других растворителей. Наиболее распространенный сорастворитель, добавляемый к углекислоте – метанол. Его добавление позволяет преодолеть матричные эффекты, когда пестициды, прочно связанные с матрицей, чистой углекислотой не экстрагируются. Кроме этого, добавка метанола или ацетона повышает растворимость в углекислоте полярных соединений.

Прямая СКЖЭ редко используется для экстракции аналитов из водной матрицы. Ограничение метода связано с проблемой образования льда и с проблемой удаления воды

По окончании пробоподготовки количественное определение пестицидов осуществляют методом ВЭЖХ и часто с УФ-детектором.

УДК 543?632.95]?636.085/.087

В.Д. Чмиль, д.б.н.

СОВРЕМЕННЫЕ ТЕНДЕНЦИИ РАЗВИТИЯ МЕТОДОВ АНАЛИЗА ОСТАТКОВ ПЕСТИЦИДОВ
(по материалам 10 Международного Конгресса ИЮПАК
по химии защиты растений)

Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя, г. Киев

С 4 по 9 августа 2002 г. в Базеле (Швейцария) проходил Международный Конгресс по химии защиты растений под эгидой Международного союза чистой и прикладной химии (IUPAC) (до 1998 года этот Конгресс был известен как Конгресс ИЮПАК по химии пестицидов). Этот Конгресс проходит раз в четыре года и является одним из знаменательных событий в календаре проведения встреч специалистов различных стран и научных дисциплин, работающих в области синтеза, использования и контроля химических средств защиты растений.

Научная программа Конгресса состояла из одного пленарного и шести секционных заседаний и более чем 20-ти постерных сессий, на которых были рассмотрены проблемы химии, биохимии и молекулярной биологии средств защиты растений от болезней, сорняков и вредителей, пестицидных формуляций и их применения, судьбы и поведения пестицидов в окружающей среде и их безопасного применения, остатков пестицидов и безопасности потребителей.

Тематика Конгресса, связанная с современным состоянием в области разработки методов анализа остатков пестицидов, которая была отражена в заказных секционных докладах и постерах, касалась следующих вопросов:
- хранение проб и стандартных растворов;
- подготовка проб к анализу;
- экстракция;
- очистка экстрактов;
- определение остатков пестицидов:
а) газожидкостная хроматография (ГЖХ);
б) высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и капиллярный электрофорез;
в) тонкослойная хроматография;
г) иммунохимический анализ;
- детектирование остатков пестицидов;
- методы анализа множественных остатков пестицидов;
- определение полихлорированных дибензодиоксинов (ПХДД) и полихлорированных дибензофуранов (ПХДФ);
- автоматические анализаторы.

Хранение проб и стандартных растворов . Очень часто отобранные пробы, содержащие остатки пестицидов, хранятся в течение какого-то времени до проведения анализа. Важно, чтобы в течение срока хранения не происходило разрушение остатков пестицидов. При изучении стабильности хранения отобранных проб воздуха на фильтр из стекловолокна и комбинированный фильтр из стекловолокна и смолы XAD-2, содержащих 9 карбаматных пестицидов, в течение 28 дней было показано, что карбофуран, изопрокарб, метомил и тиодикарб были стабильны в течение 28 дней, карбарил и оксамил были стабильны в течение 14 дней, а метиокарб и пропопоксур - в течение 7 дней .

Важным обстоятельством в анализе остатков пестицидов является стабильность действующих веществ пестицидных формуляций при хранении стандартных растворов. Например, с помощью ВЭЖХ было установлено, что растворы трибенурон-метила в ацетоне, этилацетате и ацетонитриле можно хранить при –20°С без разложения в течение 2-х месяцев . Хранение тех же растворов при 25°С в течение одной недели и двух месяцев привело к разложению трибенурон-метила на 16-24% и 82-98% соответственно. Хранение этих же растворов при 5°С привело к разложению 0,5% трибенурон-метила через неделю и около 4% после двух месяцев.

Подготовка проб к анализу . Перед взятием навески из пробы, доставленной в лабораторию для анализа, материал пробы должен быть гомогенизирован. Эта операция осуществляется с помощью дробления, размола, измельчения или смешения пробы. К сожалению, в отечественных исследованиях по разработке методик выполнения измерений (МВВ) микроколичеств пестицидов и использованию МВВ для определения остатков пестицидов, например, в овощах и фруктах, не всегда придается должное значение способу подготовки пробы для дальнейшего анализа и оборудованию, которое должно использоваться для этой операции. Недостаточно измельченная и гомогенизированная проба не позволит взять представительную навеску для анализа и приведет к низкому проценту извлечения (экстракции) анализируемых пестицидов. Так, например, сравнение способов подготовки проб овощей при определении манкоцеба с помощью электрического измельчителя (800 rpm) и ручного измельчения с помощью ножниц показало, что возврат прибавленных количеств манкоцеба составил 93 и 67% соответственно .

Хроматографические методы продолжают оставаться основным инструментом аналитической химии пестицидов. По темпам развития среди них первые места занимают капиллярная газовая хроматография (ГХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и хромато-масс-спектрометрия (ГХ/МС, ЖХ/МС). Капиллярная ГХ не имеет альтернативы при разработке методик определения множественных остатков пестицидов. p>Ряд пестицидов, используемых в сельском хозяйстве Украины, не может быть подвергнут непосредственному газохроматографичекому определению вследствие их низкой летучести или недостаточной термической стабильности. Для того, чтобы сделать возможным определение этих соединений с помощью ГХ их превращают в различные производные. Такая операция обычно повышает летучесть и уменьшает адсорбцию хроматографируемых соединений на твердых носителях, увеличивает их термостойкость и улучшает разделение. В некоторых случаях при этом достигается также и значительное увеличение чувствительности детектирования полученных производных. Все это является предметом реакционной газовой хроматографии. Нами впервые в отечественных исследованиях была показана эффективность использования реакционной газовой хроматографии в анализе пестицидов на примере определения остаточных количеств гербицидов - производных феноксиалканкарбоновых кислот (2,4-Д, 2,4-ДМ) в продуктах питания. С тех пор метод реакционной газовой хроматрографии широко используется в лабораториях Института при проведении государственных испытаний пестицидов и осуществлении государственной санитарно-гигиенической экспертизы. AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Метод ВЭЖХ продемонстрировал определенные преимущества при совместном определении пестицидов и их метаболитов в одной пробе. Это в особой степени касается тех пестицидов, которые невозможно определять с помощью ГХ вследствие их термической нестабильности, высокой полярности и низкой летучести. Использование ВЭЖХ в анализе пестицидов позволяет обойтись без трудоемкой операции получения производных. Институт одним из первых в Украине начал использование этого метода для определения пестицидов. В настоящее время ВЭЖХ - рутинный метод анализа во многих лабораториях Института. Особенно широко этот метод используется при проведении государственной санитарно-гигиенической экспертизы пищевых продуктов.

Перечисляя хроматографические методы, которые используются в анализе остатков пестицидов, нельзя не упомянуть и метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), который был открыт в 1938 г. украинскими учеными Н.А.Измайловым и М.С.Шрайбер. Полуколичественный вариант ТСХ является и в настоящее время недорогим и эффективным методом разделения, идентификации и полуколичественного определения остатков пестицидов. Именно полуколичественный вариант ТСХ сыграл большую роль в становлении химико-аналитической службы Министерства здравоохранения Украины для контроля за содержанием остатков пестицидов в продуктах питания и объектах окружающей среды, когда методы ГХ и ВЭЖХ еще не были доступны для широкого использования. Во многом это произошло благодаря работам, выполненным в стенах Института. В настоящее время ТСХ в анализе остатков пестицидов в основном используется как альтернативный аналитический метод для подтверждения правильности идентификации пестицидов, полученной с помощью методов ГХ и ВЭЖХ. ТСХ незаменимый инструмент и в анализе остатков пестицидов, когда требуется проверить очень большое число проб пищевых продуктов или объектов окружающей среды на наличие пестицидов. В таких случаях обычно применяется методология скрининга. Все пробы, давшие "положительную" реакцию, далее исследуют каким-то более специфическим инструментальным методом (ГХ, ВЭЖХ, ГХ/МС, ЖХ/МС), в то время как все отрицательные результаты скрининга принимают как окончательные без какой-либо проверки. Институт распологает комплектом оборудования для количественной ТСХ (фирма КАМАГ, Германия). Тем не менее перспективы дальнейшего использования ТСХ в анализе пестицидов прежде всего следует связывать с полуколичественным вариантом этого метода. Альтернативы этому нет.

Каждый этап применения пестицидов в мировой сельскохозяйственной практике с конца 40-х годов прошлого столетия и до настоящего времени может быть охарактеризован своими собственными химико-аналитичесчкими проблемами. Однако одна проблема в анализе остатков пестицидов остается неизменной - необходимость постоянного снижения пределов количественного определения (limit of quantitafication, LOQ) пестицидов. Достижение очень низких пределов количественного определения при использовании МВИ сопровождается уменьшением уровня достоверности (надежности идентификации) результата анализа. Часто для того, чтобы достичь очень низких пределов количественного определения необходимо использовать сложную многостадийную процедуру очистки и стадию получения производных для того, чтобы можно было использовать высокоселективные и высокочувствительные детекторы (ЭЗД, ТИД). Однако это неизбежно сопровождается потерями анализируемого вещества в ходе этих операций, что приводит к увеличению ошибки анализа. Кроме этого свой вклад вносит также непостоянство состава анализируемой матрицы от пробы к пробе. В связи с этим химик-аналитик не всегда может удовлетворить желание гигиениста и токсиколога иметь МВИ с очень низкими пределами количественного определения вследствие технических возможностей используемых приборов и методических ограничений разрабатываемой МВИ. При разработке МВИ химик-аналитик свои усилия должен фокусировать не только на достижении низких пределов количественного определения анализируемых пестицидов, но не упускать из поля зрения более важные аспекты анализа остатков пестицидов: надежность идентификации и воспроизводимость результатов. Известно, что в настоящее время в Украине в некоторых сельскохозяйственных культурах и продуктах питания содержание пестицидов не допускается (так называемые zero tolerances) или находится на уровне предела обнаружения (limit of detection, LOD), т. е. любые детектируемые остатки пестицидов считаются недопустимыми. Для таких случаев первостепенное значение приобретает надежность идентификации пестицида, а не точное количественное определение его содержания, поскольку уже сам факт обнаружения пестицида является основанием для запрещения использования сельскохозяйственного сырья или продукта питания. В этих случаях применение полуколичественного варианта ТСХ является вполне оправданным при условии, что при этом достигается надежная идентификация определяемого пестицида.

Понимая, какое важное значение в анализе остатков пестицидов имеют вопросы, связанные с повышением надежности идентификации определяемых соединений, нами были предприняты систематические исследования по изучению межмолекулярных взаимодействий хлор- и азотсодержащих пестицидов в условиях газовой и жидкостной хроматографии. При этом было впервые установлено существование корреляционных зависимостей между параметрами удерживания членов гомологических рядов сорбатов, полученных при использовании хроматографических методов с различными механизмами сорбции. Эффективность использования таких зависимостей для повышения надежности идентификации пестицидов была продемонстрирована на примере гомологических рядов хлоралканкарбоновых и хлорфеноксиалканкарбоновых кислот и их эфиров, хлорфенолов, замещенных фенилмочевин, нитрофенолов и нитрофенольных соединений, замещенных бензойных кислот, симм-триазинов, эфиров тиокарбаминовой кислоты.

Введение

Глава 1. Существующие способы определения содержания пестицидов в анализируемых объектах (обзор литературы)

1.1. Пробоподготовка с использованием твердофазной экстракции 6

1.2. Методы качественной характеристики пестицидов 16

1.3. Количественный анализ пестицидов 20

Глава 2. Техника и условия эксперимента

2.1. Определение коэффициентов распределения пестицидов в системе гексан/ацетонитрил с использованием газожидкостной и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии 24

2.2. Определение степени извлечения пестицидов из модельныхводных растворов с использованием твердофазной экстракции 30

2.3. Определение линейно-логарифмических индексов удерживания и относительных оптических плотностей пестицидов в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии 32

2.4. Количественная оценка содержания пестицидов в растительных объектах методами внешнего стандарта и стандартной добавки 34

2.5. Определение содержания пестицидов в реальных растительных объектах.39

Глава 3. Оценка степени извлечения пестицидов из модельных водных растворов в условиях твердофазной экстракции на основании их коэффициентов распределения в системе гексан/ацетонитрил и параметров гидрофобности

3.1. Особенности использования обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии при определении коэффициентов распределения пестицидов в системе гексан/ацетонитрил 42

3.2. Оценка параметров гидрофобности потенциальных фосфорорганических пестицидов по их индексам удерживания в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии 48

3.3. Оценка связи степени извлечения пестицидов из водных растворов при проведении твердофазной экстракции с их коэффициентами в системах октанол/вода и гексан/ацетонитрил 59

Глава 4. Интерпретация результатов идентификации и количественного определения пестицидов в растительных объектах

4.1. Выбор оптимальных аналитических параметров для хроматографической характеристики пестицидов 63

4.2. Сравнение методов внешнего стандарта и стандартной добавки для оценки содержания пестицидов в растительных объектах 71

Список литературы 92

Приложения 105

Введение к работе

Широкое использование химических средств защиты растений ставит анализ пестицидов в сельскохозяйственной продукции и объектах окружающей среды в ряд приоритетных задач эколого-аналитического контроля . В связи с этим, а также с новыми требованиями, предъявляемыми Ростехрегулированием к методам контроля , возникает необходимость в совершенствовании старых и разработке новых методик определения микроколичеств пестицидов [с применением газожидкостной (ГЖХ) и высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ) - хроматографии], в которых бы сочетались простота процедуры определения с максимальной надежностью получаемых результатов. Успешному решению этой задачи могут помочь новые подходы в определении следовых количеств экотоксикантов.

Важнейшими этапами проведения анализа пестицидов являются: подготовка проб и заключительная интерпретация данных, включающая как качественную, так и количественную характеристику анализируемых соединений. Подготовка проб к анализу обычно состоит из экстракции, повторной экстракции и очистки на колонке. Твердофазная экстракция (ТФЭ) представляет собой альтернативный подход в ее проведении. Она сводит ряд вышеупомянутых процедур в одну, что позволяет экономить время и реактивы. Однако для оптимизации процесса ТФЭ требуется некоторая информация о целевых веществах, в частности, об их коэффициентах распределения в гетерофазных системах растворителей 1-октанол/вода (log Р) и гексан/ацетонитрил (К р). В справочной литературе по пестицидам наряду с другими физико-химическими характеристиками приведены значения log Р пестицидов . Тем не менее, проблема их определения до сих пор остается актуальной из-за существующих трудностей, возникающих в процессе определения. Главная из них -

образование медленно расслаивающихся эмульсий обоих растворителей друг в друге. Это отражается в низкой межлабораторной воспроизводимости величин log Р пестицидов . Поэтому представляется важной систематическая характеристика пестицидов различных химических групп, прежде всего их коэффициентами распределения в системах октанол/вода и гексан/ацетонитрил, а также индексами удерживания в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии [ИУ (ВЭЖХ)]. Последние могут быть использованы не только для идентификации анализируемых соединений, но и для оценки их параметров гидрофобности. Расширение подобной базы данных физико-химических характеристик пестицидов и круга характеризуемых соединений поможет с одной стороны полноценному проведению пробоподготовки, с другой - их идентификации. Однако для однозначной и надежной качественной характеристики недостаточно одного из имеющихся параметров. Необходимо оценить информативность различных сочетаний аналитических параметров пестицидов, что позволит с максимальной надежностью решить проблему их идентификации.

Заключительной стадией анализа после пробоподготовки и качественной характеристики анализируемых соединений является количественная оценка их содержаний в исследуемых образцах. Существующие способы количественного хроматографического анализа пестицидов (абсолютная градуировка, метод внутреннего стандарта) нельзя назвать оптимальными. Метод абсолютной градуировки при наличии систематических погрешностей пробоподготовки (как правило, из-за потерь искомых веществ на разных стадиях) без введения поправочных коэффициентов приводит к заниженным результатам, а применение метода внутреннего стандарта ограничено поиском необходимого стандартного соединения и предварительной дополнительной, трудоемкой процедурой специальной подготовки проб для проведения определения.

6 Таким образом, целью настоящей работы являлись совершенствование существующих и разработка новых методик определения пестицидов в растительных объектах. Для решения этой задачи необходима оптимизация каждого из основных этапов анализа пестицидов. Предлагаемая оптимизация включает: использование ТФЭ на стадии пробоподготовки, а при заключительной интерпретации данных - выбор наиболее оптимального сочетания аналитических параметров для хроматографической идентификации пестицидов, а так же выбор и использование метода количественной их оценкой позволяющей минимизировать систематические погрешности определений.

Методы качественной характеристики пестицидов

Идентификацию пестицидов (как и любых других органических веществ) при проведении хроматографического анализа (ГЖХ и ВЭЖХ) часто осуществляют по параметрам удерживания [абсолютные и относительные времена удерживания, индексы удерживания (линейные, логарифмические, линейно-логарифмические )] на различных по полярности фазах (ГЖХ) или в различных режимах элюрования (ВЭЖХ). Проведение качественного анализа пестицидов по абсолютным временам осуществляют в строгого заданных условиях, на одном и том же приборе с использованием необходимых стандартных (эталонных) соединений. Менее зависимые от конкретных условий анализа являются относительные времена удерживания (времена удерживания относительно какого-либо стандартного вещества). Они обладают значительно большей воспроизводимостью в изотермических условиях разделения (ГЖХ) и изократическом режиме элюирования (ВЭЖХ). Их можно использовать для сравнения данных, полученных в разных стационарных режимах, на разных приборах, в разных лабораториях. Однако характер неподвижных фаз (ГЖХ), тип колонок и состав элюента (ВЭЖХ) должен оставаться при этом фиксированным. В качестве стандартного соединения рекомендуется выбирать соединение того же класса, что и определяемое. Если же определять параметры удерживания (индексы удерживания (ИУ)) относительно двух стандартов, причем один из которых имеет меньшее, а другой большее время удерживания, чем искомое соединение, то они будут характеризоваться еще большей межлабораторной воспроизводимостью, чем относительные времена удерживания. Индексы удерживания могут быть представлены в линейной, логарифмической и линейно-логарифмической форме. Индексы удерживания в логарифмической форме используют в изотермическом режиме (ГЖХ) или изократическом режиме элюирования (ВЭЖХ). В случае анализа сложных смесей в условиях программированного изменения температуры колонки (ГЖХ) применяют линейные индексы удерживания. Однако как показано в наилучшей формой представления параметров удерживания в этих условиях являются линейно-логарифмические индексы удерживания. Их преимущество заключается в высокой воспроизводимости как в режиме линейного программирования температуры, так и изотермическом режиме (ГЖХ), а так же при различных режимах элюирования (изократический, градиентный) подвижной фазы в ВЭЖХ . Индексы удерживания нашли применение не только в анализе пестицидов, но и других загрязняющих органических веществ . Однако использование хроматографических параметров удерживания связано с неоднозначностью оценок. Это обусловлено реальной возможностью их совпадения с параметрами удерживания коэкстрактивных веществ, обычно присутствующих в пробе (коэкстрактивные вещества - соединения извлекаемые из матрицы вместе с аналитом).

Другой способ идентификации веществ основан на применении селективных детекторов. Газохроматографический анализ пестицидов осуществляют при использовании трех селективных детекторов -термоионный и пламенно-фотометрический детекторы применяют в анализе азот-, фосфор-, серосодержащих соединений, а детектор электронного захвата - в анализе галогенсодержащих веществ. Использование альтернативных детекторов ограничено тем, что хотя некоторые иззарегистрированы с необходимой чувствительностью. Анализ пестицидов в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ проводят практически с одним селективным ультрафиолетовым (УФ) детектором, избирательность которого регулируется выбором фиксированных длин волн. Применение диодных матриц дает возможность регистрации поглощения на нескольких длинах волн, обеспечивая тем самым большую вероятность качественной характеристики пестицидов .

Одними из наиболее надежных путей идентификации экотоксикантов являются гибридные методы, основанные на хроматогафическом разделении анализируемых веществ и последующей идентификацией с использованием спектральных (масс-, инфракрасных-, атомно-эмиссионных) детекторов . В этом случае, помимо хроматограмм с определяемыми параметрами удерживания, регистрируют соответствующие (масс-, инфракрасные-, атомно-эмиссионные) спектры соединений. Тем не менее, как отмечено в , «ни один из известных аналитических методов не может гарантировать надежную идентификацию любых соединений». К этому следует добавить, что использование гибридных методов ограничено дорогостоящим аппаратурным оснащением.Достоинства и ограничения каждого из используемых методов качественной характеристики пестицидов иллюстрирует таблица 1.2.

Определение линейно-логарифмических индексов удерживания и относительных оптических плотностей пестицидов в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии

В работе использованы пестициды, перечень которых представлен в таблице 2.1., а также соединения (1-23) с общей структурной формулой RRP(=X)SR (таблица 2.2.), синтезированные в Институте элементорганических соединений (Москва) , физико-химические свойства которых охарактеризованы в . Разделение соединений методом обращенно-фазовой ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе «Waters» с колонкой Nova-Рас Qg (3,9 х 150 мм) и УФ-детектированием при длинах волн 220 и 254 нм. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила с водой, расход элюента 1 мл/мин. Анализ проводили в градиентном режиме элюирования с начальной концентрацией CH3CN, равной 10%, и скоростью ее изменения 1,5 % в минуту. Мертвое время системы определяли дозированием раствора бромида калия (220 нм). Регистрацию времен удерживания осуществляли с помощью программного обеспечения «Millennium». Для определения значений ИУ в образцы вводили смесь реперных н-алкилфенилкетонов PhCOCnH2n+i (n = 1-3,5). Линейно-логарифмические индексы удерживания [ИУ(ВЭЖХ)] рассчитывали с использованием программы (QBasic), приведенной в руководстве . Для вычисления значений ИУ (ВЭЖХ) соединений, имеющих меньшие, чем у первого реперного компонента (ацетофенон) времена удерживания, применяли алгоритм экстраполяции времен удерживания, охарактеризованный в . Для определения относительных оптических плотностей Аотн.= А(254)/А(220) хроматограммы параллельно регистрировали на двух указанных длинах волн с последующим вычислением отношений площадей пиков Аот„= S(254)/S(220). Расчет параметров уравнения линейной регрессии вида: log Р = al +b, где / - индексы удерживания веществ в обращенно-фазовой ВЭЖХ, a, b -коэффициенты уравнения; осуществляли с помощью программного обеспечения Origin for Windows.

Оценки значений log Р по аддитивным схемам (исходя из инкрементов log Р молекулярных фрагментов ) проводили с использованием программного обеспечения ACD и CS ChemDraw Ultra. Особенности количественной оценки содержания пестицидов в растительных объектах [огурцы (замороженные), солома, колосья, зерно] характеризовали на примере трех соединений: диметоата, пиримикарба и малатиона. Стандартные растворы пестицидов в ацетоне (х.ч.) с концентрацией 0,1 мг/мл (и 0,01 мг/мл для диметоата) готовили путем разведения исходных основных растворов с концентрацией 1 мг/мл и максимально равномерно вносили (1-2,5 мл) в необработанные (контрольные) растительные образцы с последующим встряхиванием и перемешиванием в течение 5 мин. Отсутствие определяемых пестицидов в контрольных образцах подтверждали экспериментально при использовании Подготовку проб для дальнейшего хроматографического анализа осуществляли двумя способами: с проведением ЖЭ (огурцы, солома, колосья, зерно) и с использованием ТФЭ (огурцы) Пробоподготовка с использованием жидкостной экстракции. Подготовку проб, содержащих диметоат и малатион, проводили по методике группового определения фосфорорганических пестицидов . Она включала экстракцию пестицидов из огуречных проб 50% водным ацетоном (для повышения эффективности экстракции использовали ультразвуковую ванну).

Полученные экстракты фильтровали через бумажный фильтр. Осадок на фильтре промывали 50% водным ацетоном. Повторную экстракцию пестицидов из водно-ацетоновых растворов осуществляли дихлорметаном (три раза по 30 мл). Дихлорметановые растворы сушили, пропуская их через слой безводного сульфата натрия (ч.д.а.) и упаривали досуха в вытяжном шкафу при комнатной температуре в токе воздуха. Сухой остаток растворяли в 10 мл гексана и хроматографировали. Подготовку проб, содержащих пиримикарб, проводили с использованием методики, приведенной в . Она основана на извлечении пестицида из анализируемых объектов 0,1 н раствором соляной кислоты. Полученные экстракты подщелачивали 1 н раствором едкого натра до рН 8-10 и реэкстрагировали пиримикарб хлороформом (двумя порциями по 75 мл). Хлороформные экстракты сушили, пропуская их через слой безводного сульфата натрия, и упаривали досуха в вытяжном шкафу при комнатной температуре в токе воздуха. Сухой остаток растворяли в 10 мл гексана и хроматографировали. Пробоподготовка с использованием твердофазной экстракции. Пестициды из анализируемых проб экстрагировали 50% водным ацетоном (на ультразвуковой ванне). После фильтрации водно-ацетоновых растворов и промывки осадка на фильтре (50% водным ацетоном), ацетон из объединенных экстрактов полностью упаривали. Оставшиеся водные растворы снова фильтровали через бумажный фильтр. Перед тем, как использовать в работе отечественные сорбенты Диапак С16 (партия № 1002), их активировали (активация патронов см. выше п. 2.2.). После этого прокачивали через патроны, анализируемые водные растворы со скоростью не более 2 мл/мин, создавая разрежение на выходе водоструйным насосом. Затем патроны сушили 30 минут в токе гелия. В качестве элюирующих растворителей использовали: гексан (20 мл), дихлорметан (20 мл) и ацетон (15 мл). Элюаты упаривали досуха в вытяжном шкафу при комнатной температуре.

Остатки после упаривания растворяли 10 мл гексана и хроматографировали. Газохроматографический анализ при совместном присутствии диметоата, пиримикарба и малатиона выполняли с использованием прибора «Цвет 55ОМ», укомплектованного термоионным детектором и стеклянной колонкой 2 м х 3 мм, заполненной 5% SP 2100 на Хромосорбе W (0,200 -0,250 мм). Температура колонки 220, испарителя 250, детектора 390С. Расход газа-носителя (азота) - 30 мл/мин, водорода 14 мл/мин, воздуха 200 мл/мин. Газохроматографический анализ диметоата проводили на приборе «Цвет 550М» с термоионным детектором и стеклянной колонкой 1 м х 3 мм, заполненной 5% SE-30 на Хроматоне N Super (0,125 - 0,160 мм). Температура колонки 200, испарителя 240, детектора 320С. Расход газа-носителя (азота) - 28 мл/мин, водорода 14 мл/мин, воздуха 200 мл/мин. Для дозирования проб (1 мкл) использовали микрошприц «Hamilton». Количественную оценку содержания пестицидов в анализируемых образцах с использованием метода внешнего стандарта осуществляли по уравнению (во всех случаях анализируемые объемы были одинаковы и составляли 10 мл):

Оценка параметров гидрофобности потенциальных фосфорорганических пестицидов по их индексам удерживания в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии

Среди различных свойств органических соединений коэффициенты распределения в системе 1-октанол/вода (log Р) занимают особое место. Этот параметр, предложенный как мера гидрофобности органических соединений , используют для различных целей. Одной из них является прогнозирование поведения экотоксикантов в объектах окружающей среды . Рассмотрение известных данных по деградации пестицидов в растениях и почве свидетельствуют об отчетливо выраженной зависимости продолжительности их обнаружения в таких объектах от параметров гидрофобности. Так, например, сравнительная характеристика пиретроидов и фосфорорганических пестицидов (значения log Р пиретроидов в среднем на 2-4 единицы больше, чем для ФОП) свидетельствуют о более длительном сохранении пиретроидов в различных сельскохозяйственных культурах (на 1-2 недели больше), несмотря на существенно меньшие (в несколько раз) нормы расходов. Даже в пределах одного класса соединений хорошо прослеживается зависимость продолжительности регистрации пестицидов в почве от их гидрофобности.

Например, более гидрофобные ФОП (log Р 3-4) обнаруживаются на 5-15 суток дольше, чем менее гидрофобные (log Р 1). Кроме оценки и предсказания поведения пестицидов в различных объектах окружающей среды, значения log Р могут быть использованы в качестве одного из критериев отбора новых перспективных средств защиты растений. Так, полагают , что инсектицидная активность фосфорорганических соединений также коррелирует с их гидрофобностью, и, таким образом, значения log Р, могут оказаться полезными при поиске новых инсектицидов. При проведении пробоподготовки с использованием ТФЭ на модифицированных силикагелях, как отмечено в обзоре литературы, эффективность экстракции пестицидов ряд авторов связывают с их гидрофобностью. Поэтому данный параметр представляет интерес не только для характеристики экологического поведения или для поиска новых перспективных пестицидов, но и с аналитических позиций. Экспериментальное определение log Р в системе 1-октанол/вода связано со значительными трудностями, главной из которых следует считать образование медленно расслаивающихся эмульсий обоих растворителей друг в друге. Это приводит к неоправданно длительному установлению равновесия, отсутствие которого проявляется в низкой межлабораторной воспроизводимости значений log Р для многих веществ (некоторые оценки на примере пестицидов см. в ). Известные методы определения log Р можно условно разделить на две группы - прямые и косвенные.

Прямые методы основаны на непосредственном измерении равновесных концентраций веществ в обеих (или в одной, чаще всего - водной) сосуществующих фазах. Классическим примером таких способов является широко распространенный метод «встряхивания колбы» , позволяющий определять значения log Р в диапазоне от -2,5 до +4,5. Однако в ряде случаев межлабораторная воспроизводимость получаемых с его помощью данных достигает ± 1,3 единиц log Р . Другие же методы определения log Р либо длительны , либо требуют использования специального оборудования . Сложности непосредственного измерения значений log Р привели к появлению большого количества косвенных методов их оценки. Одни из них основаны на расчете log Р по аддитивным схемам (исходя из инкрементов log Р молекулярных фрагментов , в том числе с помощью современного программного обеспечения (ACD или CS ChemDraw), другие предполагают использование двухпараметровых уравнений линейной регрессии вида (8), коэффициенты которых вычисляют методом наименьших квадратов по наборам данных для ранее охарактеризованных веществ:

В число параметров А включают как молекулярные характеристики -поляризуемость (молекулярная рефракция), потенциал ионизации, дипольный момент , так и некоторые физико-химические константы - температура кипения, растворимость в воде (только в пределах гомологических рядов) , а также экспериментально определяемые параметры удерживания в обращенно-фазовой ВЭЖХ (обычно используют логарифмы факторов удерживания или коэффициентов емкости log к1) . Несмотря на большое число примеров характеристики гидрофобности сорбатов по значениям log к (ВЭЖХ), такие хроматографические инварианты как индексы удерживания, менее зависимые от условий разделения, чем коэффициенты емкости, для этих целей до настоящего

Сравнение методов внешнего стандарта и стандартной добавки для оценки содержания пестицидов в растительных объектах

Оценка уровня содержания пестицидов в растительных объектах является ответственным и заключительным этапом в определении следовых количеств экотоксикантов. В обзоре литературы отмечено, что для этой цели используют два метода количественного хроматографического анализа: наиболее популярный - метод внешнего стандарта (разновидность метода абсолютной градуировки) и метод внутреннего стандарта. Широкое использование метода внешнего стандарта вероятно связано с простой процедурой определения.

Она заключается в анализе растворов стандарта и пробы, полученной из целевого образца с дальнейшим определением концентрации пестицида по пропорции: где Сх, Сст. - концентрации аналита в исследуемом и стандартном растворах; Мх, Мет. - количество аналита в исследуемом и стандартном растворах (при равенстве их объемов); Рх, Рст# - площадь (высота) пика аналита в исследуемом и стандартном растворах, Оценку случайной составляющей погрешности результатов количественного определения методом внешнего стандарта проводят по соотношениям: где 5СХ, 5Сст., - погрешности определения и задания концентраций пестицида в анализируемом и стандартном растворах; 5МХ, 8МСТ. погрешности определения и задания количеств пестицида в анализируемом и стандартном растворах (при равенстве их объемов); 8РХ, SPSCT. - погрешности определений площадей (высот) пиков пестицида в исследуемом и стандартном растворах. Однако на разных стадиях полготовки проб к хроматографическому анализу могут наблюдаться значительные потери пестицидов, что приводит к снижению их концентрации в конечном исследуемом растворе, и как следствие этого, к заниженным результатам определений. В обзоре литературы отмечено также, что метод внутреннего стандарта позволяет уменьшить влияние систематической погрешности на конечные результаты анализов. Его преимущество при этом было бы неоспоримо, если бы не возникали затруднения при выборе внутренних стандартов. В тоже время, такая разновидность метода внутреннего стандарта как метод стандартной добавки до настоящего времени не нашла своего применения для оценки содержания пестицидов в растительных (и других) объектах. Этот способ предусматривает использование в качестве внутреннего стандарта самого определяемого соединения. Для установления его содержания в образце (Сх) необходим анализ двух проб: исходной пробы и пробы после введения в нее известного количества стандартной добавки.

По простой пропорции (при равенстве анализируемых объемов), связывающей прирост хроматографического сигнала с добавкой исследуемого соединения, определяют его первоначальное содержание в образце: определяемое количество аналита в исходном образце; МДОб. -добавка образца сравнения; Рх, Рх+ДОб. - площади (высоты) пиков аналитов в образцах, соответствующих исходной пробе и пробе с добавкой;.т - масса исходного образца, V - объем анализируемого образца. Случайную погрешность результатов количественных определений (5МХ) методом стандартной добавки (при 8МДОб « SP и SV« 8 МДОб.) можно оценить по соотношению: где 8РХ, 8Рх+ДОб - погрешности определений площадей (высот) пиков аналитов в исходной пробе и пробе с добавкой. Сопоставление выражений (15) и (16) показывает, что случайная составляющая погрешности определений методом стандартной добавки при Рх Рх+доб будет больше, чем методом внешнего стандарта так как (Рх+ДОб / (Рх+доб - Рх) » 1, но при Рх+доб » Рх и, следовательно, Рх+доб / (Рх+Доб - Рх) « 1 они сравнимы по величине. Кроме того, ее дополнительным источником является двукратное увеличение числа экспериментальных операций при пробоподготовке. Тем не менее, уменьшение влияния систематической погрешности при использовании метода стандартной добавки (также как и в методе внутреннего стандарта), как правило, позволяет существенно снизить суммарную погрешность определений. Затраты времени на выполнение хроматографических определений методами внешнего стандарта и стандартной добавки примерно одинаковые. Однако число операций пробоподготовки при использовании метода стандартной добавки удваивается

Кочмола, Николай Максимович