kvm-mtv.ru → Интересные факты

Идентификации белков активное применение. Масс-спектрометрическая идентификация белков и белковых комплексов на чипах атомно-силового микроскопа кайшева, анна леонидовна. Подготовка к проведению анализа

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Масс-спектрометрия в протеомике.

2.1.1 Общие принципы.

2.1.2 Протеомный анализ с использованием масс-спектрометрии.

2.1.3 Идентификация белков методом отпечатков пептидных масс.

2.1.4 Идентификация белков методом отпечатков фрагментации пептидов.

2.2 Интерпретация результатов масс-спектрометрической идентификации белков.

2.2.1 Определение списка идентифицированных белков.

2.2.2 Идентификация высокогомологичных белков.

2.2.3 Базы данных аминокислотных последовательностей белков.

2.3 Масс-спектрометрический анализ продуктов одного гена.

2.3.1 Протеотипирование и популяционная протеомика.

2.3.2 Идентификация микрогетерогенности белков методом «сверху-вниз».

2.3.3 Идентификация генетически-детерминированного полиморфизма белков методом «снизу-вверх».

2.3.4 Базы данных полиморфизмов белков и генов.

2.3.5 Репозитории масс-спектрометрических данных.

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Материалы.

3.1.1 Масс-спектрометрические данные для белков микросомальной фракции печени человека.

3.1.2 Контрольный набор масс-спектров «Aurum Dataset».

3.1.3 Масс-спектрометрические данные протеомного репозитория PRIDE.

3.1.4 Базы данных аминокислотных последовательностей белков человека.

3.1.5 Данные о возможных полиморфизмах белков человека.

3.2 Методы.

3.2.1 Веб-сервер идентификации белков по масс-спектрам.

3.2.2 Пакетная обработка масс-спектров методом отпечатков пептидных масс.

3.2.3 Пакетная обработка тандемных масс-спектров.

3.2.4 Одномерное протеомное картирование.

3.2.5 Программная реализация итеративного алгоритма идентификации ОАП.

3.2.6 Валидация алгоритма идентификации ОАП.

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Увеличение степени покрытия аминокислотных последовательностей идентифицированными пептидами.

4.1.1 Идентификация белков в срезах геля.

4.1.2 Одномерные протеомные карты и их свойства.

4.1.3 Выявление высокогомологичных белков надсемейства цитохромов Р450 за счет увеличения степени покрытия аминокислотных последовательностей идентифицированными пептидами.

4.2 Идентификация ОАП в белках надсемейства цитохромов Р450.

4.3 Алгоритм идентификации ОАП.

4.3.1 Итеративная схема обработки тандемных масс-спектров.

4.3.2 Чувствительность и специфичность алгоритма идентификации ОАП.

4.4 Применение итеративного алгоритма для выявления ОАП в масс-спектрометрических данных протеомного репозитория PRIDE.

4.4.1 Исходные данные, используемые для выявления ОАП.

4.4.2 Идентификация пептидов и белков с использованием масс-спектрометрических данных, загруженных из репозитория PRIDE.

4.4.3 Идентификация одноаминокислотных полиморфизмов.

4.5 Анализ идентифицированных ОАП.

4.5.1 Анализ ОАП-содержащих пептидов.

4.5.2 Связь выявленных ОАП с заболеваниями человека.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ масс-спектров пептидных фрагментов для идентификации генетически детерминированного полиморфизма белков»

В базе данных Ensembl содержатся сведения о 20 469 кодирующих генов, полученные на основе результатов сборки генома человека, выполненной в Национальном центре биотехнологической информации США (февраль 2009). Небольшое число генов позволяет заключить, что сложность живых систем достигается на уровне регуляции транскрипции, трансляции, и пост-трансляционных модификаций. Альтернативный сплайсинг и такие модификации, как фосфорилирование, гликозилирование, наряду с протеолитическим процессингом, приводят к формированию многообразия белков, количество которых на несколько порядков превышает количество генов. Проведенные различными методами оценки показывают, что протеом человека может насчитывать несколько миллионов различающихся по своему химическому строению белков .

Традиционный подход к исследованию протеома основан на использовании иммуногистохимического окрашивания тканевых срезов. Первый вариант протеомного атласа человека пыл построен с применением антител . Использование биологических микрочипов, содержащих нанесенные на них антитела, позволяет идентифицировать и количественно измерить до нескольких сотен белков в одном образце . Однако данный подход имеет ограничения, которые связаны с необходимостью наработки и верификации антител, недостаточной специфичностью за счет перекрестных взаимодействий и относительно низкой аффинностью комплексов антиген-антитело. В связи с этим особую важность для исследования протеома приобрел более универсальный и не требующий иммуноспецифичных реагентов метод идентификации белков - биологическая масс-спектрометрия .

При масс-спектрометрическом анализе биоматериала идентификация белковых молекул осуществляется путем сопоставления измеренных масс-зарядных характеристик белков и/или их протеолитических фрагментов с теоретическими значениями, вычисленными на основании закодированных в геноме аминокислотных последовательностей. Необходимо учитывать, что в последовательности генома в явном виде не содержится информации о сайтах альтернативного сплайсинга и о возможных пост-трансляционных модификациях. Выявление случаев альтернативного сплайсинга возможно на основании экспериментальных данных: источником сведения о сплайс-изоформах являются базы данных кодирующих ДНК . Выявление посттрансляционных модификаций осуществляется с использованием высокоточной масс-спектрометрии белков или с применением тандемной масс-спектрометрии пептидных фрагментов

Наряду с альтернативным сплайсингом и пост-трансляционной модификацией, разнообразие белковых молекул увеличивается за счет трансляции несинонимичных однонуклеотидных полиморфизмов (non-synonymous Single Nucleotide Polymorphism, nsSNP). Установление наличия nsSNP производится с использованием генотипирования, тогда как подтверждение наличия соответствующей замены остатка в первичной структуре белка, то есть выявление одноаминокислотных полиморфизмов (ОАП, Single Amino Acid Polymorphism, SAP), относится к задачам протеотипирования .

Важность идентификации и исследования на белковом уровне альтернативного сплайсинга, ОАП и пост-трансляционных модификаций обусловлена влиянием данных процессов на уровень экспрессии и функциональные свойства белков. Известно, что изменение активности или уровня экспрессии белков может приводить к возникновению и развитию социально-значимых заболеваний, включая онкологические , сердечно-сосудистые и нейродегенеративные заболевания.

В геноме установлено наличие около 65 тысяч несинонимичных полиморфизмов, предположительно транслируемых в ОАП, причем более 30% предположительно приводят к изменению функциональных свойств белков . Поскольку изменение активности белков связано с развитием заболеваний, то исследования ОАП необходимы для определения структурных причин, лежащих в основе наблюдаемых функциональных нарушений . В задачи протеотипирования входит качественное и количественное определение экспрессии аллельных вариантов генов на протеомном уровне , а также мониторинг частоты встречаемости экспрессируемых аллельных вариантов белков на популяционном уровне .

Идентификация ОАП в высокопроизводительном режиме с использованием масс-спектрометрии сопряжена с техническими ограничениями. Для задачи протеотипирования наиболее адекватным является подход «сверху-вниз», то есть масс-спектрометрия интактных белков (а не их фрагментов). Однако, чувствительность такого подхода невелика, на уровне 10ч-10 5 М. Как следствие, обеспечивается идентификация десятков, реже сотен, и, только в исключительных случаях до тысячи белков. Наиболее часто в биологической масс-спектрометрии применяют другой подход - «снизу-вверх», в котором наличие в образце белка устанавливается путем идентификации его протеолитических фрагментов (пептидов) . В большинстве случаев для идентификации белка достаточно небольшого количества пептидов, которые в совокупности могут составлять не более 5% последовательности биополимера. Для оставшейся части аминокислотной последовательности белка невозможно установить наличие/отсутствие химических модификаций аминокислотных остатков или аминокислотных полиморфизмов.

Для идентификации одноаминокислотных полиморфизмов белков человека с использованием биологической масс-спектрометрии необходимо повысить степень покрытия аминокислотной последовательности белка за счет выявления дополнительных протеолитических пептидов белка. Это возможно в результате проведения эксперимента с большим числом частично или полностью повторяющихся масс-спектрометрических анализов . Кроме того, в рамках одного исследования можно объединять данные протеомных экспериментов, выполненных множеством исследовательских групп. Доступ к обширной коллекции масс-спектров предоставляется различными протеомными репозиториями , в наиболее популярном из которых - PRIDE (Protein Identification Database) -хранятся результаты более 13 тысяч протеомных экспериментов. Чем выше окажется степень покрытия аминокислотной последовательности белка идентифицированными пептидами, тем больше вероятность подтвердить наличие или отсутствие одноаминокислотных замен в структуре белка.

При наличии обширного объема масс-спектрометрических данных решение задачи протеотипирования возможно за счет использования вычислительных методов биоинформатики. Например, анализ масс-спектрометрических данных может осуществляться с использованием баз данных экспрессируемых фрагментов (EST), в которых содержится информация о транслированных вариантах несинонимичных полиморфизма генов . Второй способ, реализованный во многих программах идентификации белков, представляет собой сравнение масс-спектров с базой данных теоретических последовательностей белков, допускающий наличие неточностей в виде замен аминокислотных остатков .

Недостатки указанных выше подходов хорошо известны . В базах данных экспрессируемых фрагментов содержится избыточная информация, включая ошибки секвенирования, что усложняет анализ результатов масс-спектрометрического исследования . Анализируя образец, в котором идентифицировано несколько сотен белков, полученные масс-спектры необходимо сопоставлять с накопленными за десятки лет сотнями тысяч транскриптов, в числе которых содержится более 5% ошибок . При анализе масс-спектров с допущением возможных неточностей в базе данных, игнорируется информация о реально существующих несинонимичных заменах, которые были установлены генотипированием. Искусственные допущения, введенные в базу данных или в алгоритм идентификации белков, приводят к снижению достоверности результатов. Указанные недостатки существующих методов протеотипирования обуславливают необходимость совершенствования вычислительных подходов к идентификации ОАП.

Целью работы являлась разработка способа анализа масс-спектрометрических данных для идентификации единичных аминокислотных полиморфизмов, возникающих в результате трансляции несинонимичных нуклеотидных замен в соответствующих генах, и применение разработанного способа для выявления аминокислотных замен в белках человека. Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Провести обработку масс-спектров пептидных фрагментов для повышения степени покрытия аминокислотных последовательностей белков идентифицированными пептидами.

2. На модельном наборе масс-спектрометрических данных, обеспечивающих высокую степень покрытия последовательностей, разработать метод выявления одноаминокислотных замен в белках человека.

3. Обобщить метод выявления одноаминокислотных замен в форме универсального алгоритма обработки тандемных масс-спектров; оценить чувствительность и специфичность созданного алгоритма.

4. Применить созданный алгоритм для обработки репозитория масс-спектрометрических данных, определить одноаминокислотные полиморфизмы и охарактеризовать белки человека, содержащие выявленные полиморфизмы.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Термин «протеом» - полная совокупность экспрессируемых в организме белков - был впервые предложен Марком Вилкинсом в связи с обозначившейся необходимостью дополнить знания о геномах соответствующей информацией о кодируемых в них белках . Объектом исследования при анализе протеома может выступать как целый организм, так и клеточный компонент, ткань, субклеточная структура, например, ядро, микросомальная фракция и др. .

Результаты проведения широкомасштабной инвентаризации белков с использованием масс-спектрометрии были опубликованы в работе Шевченко и соавторов в 1996 году . Появление биологической масс-спектрометрии ознаменовало наступление эры высокопроизводительных постгеномных технологий, позволяющих в результате проведения одного эксперимента получить информацию о генах и белках в масштабе всего организма. К постгеномным технологиям, кроме протеомики, относятся также геномика и транскриптомика. При анализе генетического материала постгеномные технологии позволяют устанавливать наличие полиморфизма генов с применением полногеномного ре-секвенирования или высокоплотного картирования однонуклеотидных замен (SNP).

Существующие подходы к исследованию многообразия белков можно разделить на два направления. В первом случае перед постановкой эксперимента заранее задано, идентификацию каких именно белковых молекул планируется провести. При таком подходе идентификацию белков проводят с использованием антител, которые применяют для гистохимического окрашивания тканевых срезов с последующим получением микрофотографий клеток. На микрофотографии среза флуоресцирующие участки соответствуют местам локализации выявляемого белка-антигена, причем интенсивность флуоресценции позволяет получить количественную оценку содержания этого белка.

В рамках крупного международного проекта ProteinAtlas осуществляется масштабная наработка антител к белкам всех генов человека . В ходе выполнения этого проекта было получено и размещено для общественного пользования более 400 000 микрофотографий иммуногистохимических окрашенных срезов практически для всех тканей человека. Сравнительный анализ распределения специфичной окраски белков позволил, в частности, выявить характерные профили экспрессии белков для раковых тканей. Однако, окрашивание тканевых срезов с использованием флуоресцентно-меченных антител является довольно грубым методом исследования протеома. Во-первых, как указывают сами разработчики проекта ProteinAtlas, качество многих коммерчески доступных антител крайне низкое. Примерно половина закупленных антител при верификации показывает низкую специфичность к исследуемому антигену, а также препараты антител часто характеризуются низкой чистотой. Во-вторых, большое количество комплексов антиген-антитело характеризуются константой диссоциации (107-108 М) , что обуславливает ограничение по чувствительности при измерении концентрации белков .

Кроме гистохимического анализа, исследование протеома осуществляется с использованием биологических микрочипов. Белковые микрочипы являются эффективным инструментом трансляционной медицины , но ограниченным по возможностям использования для широкомасштабного исследования протеома. Применение микрочиповых технологий в протеомике редко позволяет проводить идентификацию более десяти белков единовременно: при увеличении количества анализируемых белков стандартизация условий протекания взаимодействия антиген-антитело затруднена. Так, применение микрочипов приводит к появлению ложно-отрицательных результатов в случае, когда для комплексов антиген-антитело различия констант диссоциации составляют несколько порядков. Кроме того, стабильность антител очень сильно зависит от условий их хранения, поэтому использование белковых микрочипов ограничено временем непосредственно после их изготовления, что не позволяет данному виду анализа получить широкое распространение.

Второе направление исследований протеома связано с постановкой эксперимента в нак называемом «панорамном» (survey) режиме, когда заранее неизвестно, какие белки могут быть идентифицированы. Потенциально, в результате панорамного эксперимента могут быть идентифицированы любые белки, закодированные в геноме исследуемого организма, включая даже продукты считающихся не кодирующими участков генома. Технические и методические средства для полногеномного исследования протеома обеспечиваются биологической масс-спектрометрией.

Заключение диссертации по теме «Математическая биология, биоинформатика», Чернобровкин, Алексей Леонидович

1. Проведено протеомное картирование масс-спектрометрических данных, включающее идентификацию белков методом отпечатка пептидных масс с последующим анализом, направленным на выявление белок-специфичных протеотипических пептидов. На примере белков надсемейства цитохромов Р450 показано, что за счет картирования зон локализации белков в геле степень покрытия последовательности идентифицированными пептидными фрагментами увеличивается на 27 %.

2. Идентифицированы протеолитические пептиды, специфичные для форм цитохромов Р450 CYP3A4 и CYP3A5, идентичность последовательностей которых составляет 82%. Выявлены аллельные варианты трансляции цитохромов CYP3A4 и CYP3A5, содержащие одноаминокислотные полиморфизмы M445N (ЗА4), К96Е (ЗА4), L82R (ЗА5) и D277E (ЗА5).

3. Разработан итеративный алгоритм, предназначенный для идентификации одноаминокислотных полиморфизмов белков по тандемным масс-спектрам протеолитических пептидов. При тестировании на контрольном наборе «Aurum Dataset» алгоритм выявления полиморфизмов показал специфичность более 95%. Чувствительность алгоритма была на уровне 30%, что соответствует средней степени покрытия последовательностей, включенных в контрольный набор.

4. В результате анализа масс-спектрометрических экспериментов, депонированных в репозитории PRIDE, выявлено в общей сложности 270 одноаминокислотных полиморфизмов в 156 белках человека, в том числе 51 ОАП (45 белков) ассоциированы с заболеваниями, включая нарушения в системе свертываемости крови и системные амилоидозы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Чернобровкин, Алексей Леонидович, 2012 год

1. Арчаков А.И. и др. Способ повышения точности определения последовательности аминокислотных остатков биополимера на основе данных массспектрометрического анализа, вычислительная система //2010.

2. Арчаков А.И. и др. Цитохромы Р450, лекарственная болезнь и персонифицированная медицина. Часть 1 // Клиническая медицина. 2008. Т. 86. № 2. С. 4-8.

3. Клюев H.A., Бродский Е.С. Современные методы масс-спектрометрического анализа органических соединений // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2002. Т. XLVI. № 4. С. 57-63.

4. Лисица A.B. и др. Одномерное протеомное картирование цитохромов Р450 печени человека // Биохимия. 2009. Т. 74. № 2. С. 153-161.

5. Мясоедова К.Н. Новое в изучении цитохромов Р450 // Биохимия. 2008. Т. 73. №9. С. 1199-1205.

6. Петушкова H.A. и др. Идентификация цитохромов Р450 микросом клеток печени человека с помощью масс-спектрометрии // Биомедицинская химия. 2007. Т. 53. №4. С. 400-11.

7. Пономаренко Е.А., Ильгисонис Е.В., Лисица A.B. Технологии знаний в протеомике // Биоорганическая химия. 2011. Т. 37. № 2. С. 190-198.

8. Пономаренко Е.А. и др. Выявление дифференциально-экспрессирующихся белков с испольованием автоматического мета-анализа протеомных публикаций // Биомедицинская химия. 2009. Т. 3. № 1. С. 10-16.

9. Савельева М. и др. Значение генетического полиморфизма изоферментов цитохрома Р450 для персонализированного выбора и режимов дозирования антидепрессантов и антипсихотиков // Клиническая медицина. 2008. Т. 86. № 11. С. 22-28.

10. A gene-centric human proteome project: HUPO~the Human Proteome organization. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2010. Т. 9. № 2. С. 4279.

11. Aebersold R., Mann M. Mass spectrometry-based proteomics. // Nature. 2003. T. 422. № 6928. C. 198-207.

12. Ahrne E., Mtiller M., Lisacek F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS // Proteomics. 2010. T. 10. № 4. C. 671-686.

13. Akiyama M. h «p. Ichthyosis bullosa of Siemens: its correct diagnosis facilitated by molecular genetic testing. // The British journal of dermatology. 2005. T. 152. №6. C. 1353-6.

14. Alves G. h jxp. Calibrating E-values for MS2 database search methods. // Biology direct. 2007. T. 2. № 1. C. 26.

15. Alves G., Ogurtsov A.Y., Yu Y.-K. RAId DbS: mass-spectrometry based peptide identification web server with knowledge integration. // BMC genomics. 2008. T. 9. C. 505.

16. Archakov A. h zip. Biospecific irreversible fishing coupled with atomic force microscopy for detection of extremely low-abundant proteins. // Proteomics. 2009. T. 9. № 5. C. 1326-43.

17. Archakov A. h ap. Gene-centric view on the human proteome project: the example of the Russian roadmap for chromosome 18. // Proteomics. 2011. T. 11. № 10. C. 1853-6.

18. Archakov A.I. h zip. AFM fishing nanotechnology is the way to reverse the Avogadro number in proteomics. // Proteomics. 2007. T. 7. № 1. C. 4-9.

19. Archakov A.I., Bachmanova G.I. Cytochrome P-450 and active oxygen. London: Taylor & Francis, 1990.

20. Asara J.M. h ^p. A label-free quantification method by MS/MS TIC compared to SILAC and spectral counting in a proteomics screen. // Proteomics. 2008. T. 8. № 5. C. 994-9.

21. Bairoch A., Apweiler R. The SWISS-PROT protein sequence database and its supplement TrEMBL in 2000. // Nucleic acids research. 2000. T. 28. № 1. C. 45-8.

22. Baldwin M. a. Protein identification by mass spectrometry: issues to be considered. //Molecular & cellular proteomics: MCP. 2004. T. 3. № 1. C. 1-9.

23. Bantscheff M. h ap. Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors. // Nature biotechnology. 2007a. T. 25. № 9. C. 1035-44.

24. Bantscheff M. h ,qp. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. //Analytical and bioanalytical chemistry. 2007b. T. 389. № 4. C. 1017-31.

25. Barsnes H. h ap. PRIDE Converter: making proteomics data-sharing easy. // Nature biotechnology. 2009. T. 27. № 7. C. 598-9.

26. Baumgardner L.A. h Fast parallel tandem mass spectral library searching using GPU hardware acceleration. // Journal of proteome research. 2011. T. 10. № 6. C. 2882-8.

27. Beck F. h ap. The good, the bad, the ugly: Validating the mass spectrometric analysis of modified peptides // PROTEOMICS. 2011. C. n/a-n/a.

28. Bell A.W. h /jp. The protein microscope: incorporating mass spectrometry into cell biology. //Nature methods. 2007. T. 4. № 10. C. 783-4.

29. Binz P.-A. h ,qp. A Molecular Scanner To Automate Proteomic Research and To Display Proteome Images // Analytical Chemistry. 1999. T. 71. № 21. C. 49814988.

30. Binz P.-A. h pp. The molecular scanner: concept and developments. // Current opinion in biotechnology. 2004. T. 15. № 1. C. 17-23.

31. Birney E. h ap. An overview of Ensembl. // Genome research. 2004. T. 14. № 5. C. 925-8.

32. Birney E., Clamp M., Hubbard T. Databases and tools for browsing genomes. // Annual review of genomics and human genetics. 2002. T. 3. C. 293-310.

33. Bochet P. h flp. Fragmentation-free LC-MS can identify hundreds of proteins // PROTEOMICS. 2010. T. 11. № 1. C. n/a-n/a.

34. Boguski M.S., Lowe T.M., Tolstoshev C.M. dbEST-database for "expressed sequence tags". // Nature genetics. 1993. T. 4. № 4. C. 332-3.

35. Borges C.R. h np. Full-length characterization of proteins in human populations. // Clinical chemistry. 2010. T. 56. № 2. C. 202-11.

36. Bromberg Y., Rost B. SNAP: predict effect of non-synonymous polymorphisms on function. //Nucleic acids research. 2007. T. 35. № 11. C. 3823-35.

37. Brosch M. h np. Comparison of Mascot and XITandem performance for low and high accuracy mass spectrometry and the development of an adjusted Mascot threshold. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2008. T. 7. № 5. C. 962-70.

38. Bunger M.K. h ^p. Detection and validation of non-synonymous coding SNPs from orthogonal analysis of shotgun proteomics data. // Journal of proteome research. 2007. T. 6. № 6. C. 2331-40.

39. Bunkenborg J. h jip. Screening for N-glycosylated proteins by liquid chromatography mass spectrometry. // Proteomics. 2004. T. 4. № 2. C. 454-65.

40. Butenas S., Mann K.G., Butenas B. Blood Coagulation. : MAIK Nauka/Interperiodica distributed exclusively by Springer Science+Business Media LLC., 2002.

41. Canas B. h jyp. Mass spectrometry technologies for proteomics. // Briefings in functional genomics & proteomics. 2006. T. 4. № 4. C. 295-320.

42. Care M.A. h Deleterious SNP prediction: be mindful of your training data! // Bioinformatics (Oxford, England). 2007. T. 23. № 6. C. 664-72.

43. Casado-Vela J. h flp. Lights and shadows of proteomic technologies for the study of protein species including isoforms, splicing variants and protein post-translational modifications. // Proteomics. 2011. T. 11. № 4. C. 590-603.

44. Chapman P.F. h ap. Genes, models and Alzheimer"s disease // Trends in Genetics. 2001. T. 17. № 5. C. 254-261.

45. Chen M. h ap. Annotation of Non-Synonymous Single Polymorphisms in Human Liver Proteome by Mass Spectrometry // Protein and Peptide Letters. 2010. T. 17. № 3. C. 277-286.

46. Chen R. h zip. Glycoproteomics analysis of human liver tissue by combination of multiple enzyme digestion and hydrazide chemistry. // Journal of proteome research. 2009. T. 8. № 2. C. 651-61.

47. Choudhary J.S. h Interrogating the human genome using uninterpreted mass spectrometry data. // Proteomics. 2001a. T. 1. № 5. C. 651-67.

48. Choudhary J.S. h «p. Matching peptide mass spectra to EST and genomic DNA databases. // Trends in biotechnology. 2001b. T. 19. № 10 Suppl. C. S17-22.

49. Choudhury V. h ap. Two novel antithrombin variants (L99V and Q118P) which alter the heparin binding // Nouvelle Revue Française. 1994. T. 36. C. 268.

50. Colinge J., Bennett K.L. Introduction to computational proteomics. // PLoS computational biology. 2007. T. 3. № 7. C. el 14.

51. Cooksey A.M. h ap. Identifying blood biomarkers and physiological processes that distinguish humans with superior performance under psychological stress. // PloS one. 2009. T. 4. № 12. C. e8371.

52. Cooper D. The human gene mutation database // Nucleic Acids Research. 1998. T. 26. № l.C. 285-287.

53. Côté R.G. h up. The Ontology Lookup Service: more data and better tools for controlled vocabulary queries. // Nucleic acids research. 2008. T. 36. № Web Server issue. C. W372-6.

54. Cottrell J.S. Protein identification by peptide mass fingerprinting. // Peptide research. 1994. T. 7. № 3. C. 115-24.

55. Craig R., Beavis R.C. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. // Bioinformatics (Oxford, England). 2004. T. 20. № 9. C. 1466-7.

56. Craig R., Cortens J.P., Beavis R.C. Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. // Journal of proteome research. 2004. T. 3. № 6. C. 1234-42.

57. Creasy D.M., Cottrell J.S. Error tolerant searching of uninterpreted tandem mass spectrometry data // PROTEOMICS. 2002. T. 2. № 10. C. 1426-1434.

58. Crockett D.K. h ap. Annotated proteome of a human T-cell lymphoma. // Journal of biomolecular techniques: JBT. 2005. T. 16. № 4. C. 341-6.

59. Dai D. h jvp. Identification of Variants of CYP3A4 and Characterization of Their Abilities to Metabolize Testosterone and Chlorpyrifos // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. T. 299. № 3. C. 825-831.

60. Delahunty C., Yates J.R. Identification of proteins in complex mixtures using liquid chromatography and mass spectrometry. // Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino . et al.. 2003. T. Chapter 5. C. Unit 5.6.

61. Delahunty C.M., Iii J.R.Y. Tech Insight MudPIT: multidimensional protein identification technology Tech Insight // Biotechniques. 2007. T. 43. № 5.

62. Desiere F. h jjp. The PeptideAtlas project. // Nucleic acids research. 2006. T. 34. № Database issue. C. D655-8.

63. Deutsch E. mzML: a single, unifying data format for mass spectrometer output. // Proteomics. 2008. T. 8. № 14. C. 2776-7.

64. Deutsch E.W. The PeptideAtlas Project. // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2010. T. 604. C. 285-96.

65. Deutsch E.W. h ^p. A guided tour of the Trans-Proteomic Pipeline. // Proteomics. 2010. T. 10. №6. C. 1150-9.

66. Deutsch E.W. h ^p. Human Plasma PeptideAtlas. // Proteomics. 2005. T. 5. № 13. C. 3497-500.

67. Deutsch E.W., Lam H., Aebersold R. PeptideAtlas: a resource for target selection for emerging targeted proteomics workflows. // EMBO reports. 2008. T. 9. № 5. C. 429-34.

68. Eckel-Passow J.E. h jsp. An insight into high-resolution mass-spectrometry data. // Biostatistics (Oxford, England). 2009. T. 10. № 3. C. 481-500.

69. Eng J.K., McCormack A.L., Yates III J.R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 1994. T. 5. № 11. C. 976-989.

70. Eriksson J., Fenyo D. Probity: A Protein Identification Algorithm with Accurate Assignment of the Statistical Significance of the Results // Journal of Proteome Research. 2004. T. 3. № 1. C. 32-36.

71. Falkner J. a h up. Validated MALDI-TOF/TOF mass spectra for protein standards. // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2007. T. 18. № 5. C. 850-5.

72. Farrah T. h A high-confidence human plasma proteome reference set with estimated concentrations in PeptideAtlas. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2011.

73. Field D., Wilson G., Gast C. van der. How do we compare hundreds of bacterial genomes? // Current opinion in microbiology. 2006. T. 9. № 5. C. 499-504.

74. Frazer K. a h ap. A second generation human haplotype map of over 3.1 million SNPs. //Nature. 2007. T. 449. № 7164. C. 851-61.

75. Fredman D. h ap. HGVbase: a curated resource describing human DNA variation and phenotype relationships. // Nucleic acids research. 2004. T. 32. № Database issue. C.D516-9.

76. Freed G.L. h ^p. Differential capture of serum proteins for expression profiling and biomarker discovery in pre- and posttreatment head and neck cancer samples. // The Laryngoscope. 2008. T. 118. № 1. C. 61-8.

77. Gabellini N. NTRK2 (Neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2) // Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. 2008. T. 12. № 4. C. 314-317.

78. Galeva N. Direct Identification of Cytochrome P450 Isozymes by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight-Based Proteomic Approach // Drug Metabolism and Disposition. 2003. T. 31. № 4. C. 351-355.

79. Galeva N., Altermann M. Comparison of one-dimensional and two-dimensional gel electrophoresis as a separation tool for proteomic analysis of rat liver microsomes: cytochromes P450 and other membrane proteins. // Proteomics. 2002. T. 2. № 6. C. 713-22.

80. Gao M. h j\p. Large scale depletion of the high-abundance proteins and analysis of middle- and low-abundance proteins in human liver proteome bymultidimensional liquid chromatography. // Proteomics. 2008. T. 8. № 5. C. 93947.

81. Garcia-Blanco M. a, Baraniak A.P., Lasda E.L. Alternative splicing in disease and therapy. // Nature biotechnology. 2004. T. 22. № 5. C. 535-46.

82. Gatlin C.L. h ap. Automated Identification of Amino Acid Sequence Variations in Proteins by HPLC/Microspray Tandem Mass Spectrometry // Analytical Chemistry. 2000. T. 72. № 4. C. 757-763.

83. Gobom J. h £p. A Calibration Method That Simplifies and Improves Accurate Determination of Peptide Molecular Masses by MALDI-TOF MS // Analytical Chemistry. 2002. T. 74. № 15. C. 3915-3923.

84. Griss J. h ap. Published and Perished? the influence of the searched protein database on the long-term storage of proteomics data. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2011. T. 10. № 9. C. Ml 11.008490.

85. Grone J. h ^p. Differential expression of genes encoding tight junction proteins in colorectal cancer: frequent dysregulation of claudin-1, -8 and -12. // International journal of colorectal disease. 2007. T. 22. № 6. C. 651-9.

86. Hamosh A. h £p. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), a knowledgebase of human genes and genetic disorders. // Nucleic acids research. 2005. T. 33. № Database issue. C. D514-7.

87. Hamosh A. h ap. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). // Human mutation. 2000. T. 15. № 1. C. 57-61.

88. Han X., Aslanian A., Yates III J.R. Mass spectrometry for proteomics // Current Opinion in Chemical Biology. 2008. T. 12. № 5. C. 483-490.

89. Hedden P. h ap. Gibberellin Biosynthesis in Plants and Fungi: A Case of Convergent Evolution? // Journal of plant growth regulation. 2001. T. 20. № 4. C. 319-331.

90. Hopfgartner G. h Triple quadrupole linear ion trap mass spectrometer for the analysis of small molecules and macromolecules. // Journal of mass spectrometry: JMS. 2004. T. 39. № 8. C. 845-55.

91. Huang Y. n flp. Statistical characterization of the charge state and residue dependence of low-energy CID peptide dissociation patterns. // Analytical chemistry. 2005. T. 77. № 18. C. 5800-13.

92. Hubbard T. The Ensembl genome database project // Nucleic Acids Research. 2002. T. 30. № 1. C. 38-41.

93. Hustert E. h £p. The genetic determinants of the CYP3A5 polymorphism. // Pharmacogenetics. 2001. T. 11. № 9. c. 773-9.

94. Ilina E.N. h ^p. Direct bacterial profiling by matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry for identification of pathogenic Neisseria. // The Journal of molecular diagnostics: JMD. 2009. T. 11. № 1. C. 7586.

95. Ingelman-Sundberg M. Human drug metabolising cytochrome P450 enzymes: properties and polymorphisms. // Naunyn-Schmiedeberg"s archives of pharmacology. 2004. T. 369. № 1. C. 89-104.

96. International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. // Nature. 2004. T. 431. № 7011. C. 931 -45.

97. Ishihama Y. h pp. Exponentially modified protein abundance index (emPAI) for estimation of absolute protein amount in proteomics by the number of sequenced peptides per protein. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2005. T. 4. № 9. C. 1265-72.

98. Jain R., Wagner M. Kolmogorov-Smirnov scores and intrinsic mass tolerances for peptide mass fingerprinting. // Journal of proteome research. 2010. T. 9. № 2. C. 737-42.

99. Jeffrey L. Cummings. Genotype-proteotype-phenotype relationships in neurodegenerative diseases. : Springer, 2005.

100. Jenkins R.E. h ap. Relative and absolute quantitative expression profiling of cytochromes P450 using isotope-coded affinity tags. // Proteomics. 2006. T. 6. № 6. C. 1934-47.

101. Jones P. h flp. PRIDE: a public repositoiy of protein and peptide identifications for the proteomics community. // Nucleic acids research. 2006. T. 34. № Database issue. C. D659-63.

102. Jones P. h flp. PRIDE: new developments and new datasets. // Nucleic acids research. 2008. T. 36. № Database issue. C. D878-83.

103. Kalmar L. h jip. Mutation screening of the CI inhibitor gene among Hungarian patients with hereditary angioedema. // Human mutation. 2003. T. 22. № 6. C. 498.

104. Keller A. h ap. Empirical Statistical Model To Estimate the Accuracy of Peptide Identifications Made by MS/MS and Database Search // Analytical Chemistry. 2002. T. 74. № 20. C. 5383-5392.

105. Kersey P.J. n jjp. The International Protein Index: an integrated database for proteomics experiments. // Proteomics. 2004. T. 4. № 7. C. 1985-8.

106. Kim S., Gupta N., Pevzner P. a. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. // Journal of proteome research. 2008. T. 7. № 8. C. 3354-63.

107. Klie S. h £p. Analyzing large-scale proteomics projects with latent semantic indexing. // Journal of proteome research. 2008. T. 7. № 1. C. 182-91.

108. Kremer H. h up. Ichthyosis Bullosa of Siemens Is Caused by Mutations in the Keratin 2e Gene. // Journal of Investigative Dermatology. 1994. T. 103. № 3. C. 286-289.

109. Kuehl P. h ap. Sequence diversity in CYP3A promoters and characterization of the genetic basis of polymorphic CYP3A5 expression. // Nature genetics. 2001. T. 27. №4. C. 383-91.

110. Kuhn R.M. h up. The UCSC Genome Browser Database: update 2009. // Nucleic acids research. 2009. T. 37. № Database issue. C. D755-61.

111. Kuster B. h flp. Mass spectrometry allows direct identification of proteins in large genomes. //Proteomics. 2001. T. 1. № 5. c. 641-50.

112. Lane C.S. h ap. Comparative cytochrome P450 proteomics in the livers of immunodeficient mice using 180 stable isotope labeling. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2007. T. 6. № 6. C. 953-62.

113. Lane C.S. h ,qp. Identification of cytochrome P450 enzymes in human colorectal metastases and the surrounding liver: a proteomic approach. // European journal of cancer (Oxford, England: 1990). 2004. T. 40. № 14. C. 2127-34.

114. Lane E.B., McLean W.H.I. Keratins and skin disorders. // The Journal of pathology. 2004. T. 204. № 4. C. 355-66.

115. Levine a J. P53, the Cellular Gatekeeper for Growth and Division. // Cell. 1997. T. 88. № 3. C. 323-31.

116. Levy S. h AP- The diploid genome sequence of an individual human. // PLoS biology. 2007. T. 5. № 10. C. e254.

117. Lewis D.F.V. 57 varieties: the human cytochromes P450. // Pharmacogenomics. 2004. T. 5. № 3. C. 305-18.

118. Lim A. h ap. Characterization of Transthyretin Variants in Familial Transthyretin Amyloidosis by Mass Spectrometric Peptide Mapping and DNA Sequence Analysis // Analytical Chemistry. 2002. T. 74. № 4. C. 741-751.

119. Lim H. Identification of 2D-gel proteins: A comparison of MALDI/TOF peptide mass mapping to p LC-ESI tandem mass spectrometry // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2003. T. 14. № 9. C. 957-970.

120. Lisitsa A.V. h «p. Application of slicing of one-dimensional gels with subsequent slice-by-slice mass spectrometry for the proteomic profiling of human liver cytochromes P450. // Journal ofproteome research. 2010. T. 9. № 1. C. 95-103.

121. Liu T. h ap. High dynamic range characterization of the trauma patient plasma proteome. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2006. T. 5. № 10. C. 1899913.

122. Liu T. h /ip. Human Plasma N-Glycoproteome Analysis by Immunoaffinity Subtraction, Hydrazide Chemistry, and Mass Spectrometry // Journal of proteome research. 2005. T. 4. № 6. C. 2070-2080.

123. Mallick P. h flp. Computational prediction of proteotypic peptides for quantitative proteomics. //Nature biotechnology. 2007. T. 25. № 1. C. 125-31.

124. Mann M., Jensen O.N. Proteomic analysis of post-translational modifications. // Nature biotechnology. 2003. T. 21. № 3. C. 255-61.

125. Mann M., Wilm M. Error-Tolerant Identification of Peptides in Sequence Databases by Peptide Sequence Tags // Analytical Chemistry. 1994. T. 66. № 24. C. 4390-4399.

126. Marchetti A. h pp. Frequent mutations in the neurotrophic tyrosine receptor kinase gene family in large cell neuroendocrine carcinoma of the lung. // Human mutation. 2008. T. 29. № 5. C. 609-16.

127. Marichal P. h Contribution of mutations in the cytochrome P450 14{alpha}-demethylase (Ergllp, Cyp51p) to azole resistance in Candida albicans // Microbiology. 1999. T. 145. № 10. C. 2701-2713.

128. Martens L. h jxp. PRIDE: the proteomics identifications database. // Proteomics. 2005. T. 5. №13. C. 3537-45.

129. Matthiesen R., Amorim A. Proteomics facing the combinatorial problem. // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2010. T. 593. C. 175-86.

130. McDonald W.H., Yates J.R. Shotgun proteomics: integrating technologies to answer biological questions. // Current opinion in molecular therapeutics. 2003. T. 5. № 3. C. 302-9.

131. Menon R., Omenn G.S. Proteomic characterization of novel alternative splice variant proteins in human epidermal growth factor receptor 2/neu-induced breast cancers. // Cancer research. 2010. T. 70. № 9. C. 3440-9.

132. Menschaert G. h £p. Peptidomics coming of age: a review of contributions from a bioinformatics angle. // Journal of proteome research. 2010. T. 9. № 5. C. 205161.

133. Millar D.S. h Three novel missense mutations in the antithrombin III (AT3) gene causing recurrent venous thrombosis. // Human genetics. 1994. T. 94. № 5. C. 509-12.

134. Mironov A.A. Frequent Alternative Splicing of Human Genes // Genome Research. 1999. T. 9. № 12. C. 1288-1293.

135. Modrek B. Genome-wide detection of alternative splicing in expressed sequences of human genes //Nucleic Acids Research. 2001. T. 29. № 13. C. 2850-2859.

136. Mueller M. h ap. Analysis of the experimental detection of central nervous system-related genes in human brain and cerebrospinal fluid datasets. // Proteomics. 2008. T. 8. № 6. C. 1138-48.

137. Nagaraj S.H., Gasser R.B., Ranganathan S. A hitchhiker"s guide to expressed sequence tag (EST) analysis. // Briefings in bioinformatics. 2007. T. 8. № 1. C. 621.

138. Nedelkov D. Population proteomics: Investigation of protein diversity in human populations // Proteomics. 2008. T. 8. № 4. C. 779-86.

139. Nedelkov D. h ap. High-throughput comprehensive analysis of human plasma proteins: a step toward population proteomics. // Analytical chemistry. 2004. T. 76. № 6. C. 1733-7.

140. Nedelkov D. h ^p. Investigating diversity in human plasma proteins. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005. T. 102. № 31. C. 10852-7.

141. Nesvizhskii A.I. Protein identification by tandem mass spectrometry and sequence database searching. // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2007. T. 367. C. 87-119.

142. Nesvizhskii A.I., Vitek O., Aebersold R. Analysis and validation of proteomic data generated by tandem mass spectrometry // Nature Methods. 2007. T. 4. № 10. C. 787-797.

143. Ng P.C. h flp. Genetic Variation in an individual human exome // PLoS Genetics. 2008. T. 4. № 8.

144. Ong S.-E., Mann M. Mass spectrometry-based proteomics turns quantitative. // Nature chemical biology. 2005. T. 1. № 5. c. 252-62.

145. Ossipova E., Fenyô D., Eriksson J. Optimizing search conditions for the mass fingerprint-based identification of proteins. // Proteomics. 2006. T. 6. № 7. C. 2079-85.

146. Overbeek R. h ,np. Annotation of bacterial and archaeal genomes: improving accuracy and consistency. // Chemical reviews. 2007. T. 107. № 8. C. 3431-47.

147. Pedrioli P.G.A. Trans-proteomic pipeline: a pipeline for proteomic analysis. // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2010. T. 604. C. 213-38.

148. Perkins D.N. h ^p. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data // Electrophoresis. 1999. T. 20. № 18. C. 3551-3567.

149. Perry D.J., Carrell R.W. Molecular genetics of human antithrombin deficiency. // Human mutation. 1996. T. 7. № 1. C. 7-22.

150. Petrak J. h ap. Déjà vu in proteomics. A hit parade of repeatedly identified differentially expressed proteins. // Proteomics. 2008. T. 8. № 9. C. 1744-9.

151. Pevzner P.A. h /ip. Efficiency of database search for identification of mutated and modified proteins via mass spectrometry. // Genome research. 2001. T. 11. № 2. C. 290-9.

152. Porter C.J., Talbot C.C., Cuticchia A.J. Central mutation databases-a review. // Human mutation. 2000. T. 15. № 1. C. 36-44.

153. Rabilloud T., Hochstrasser D., Simpson R.J. Is a gene-centric human proteome project the best way for proteomics to serve biology? // Proteomics. 2010. C. 1-6.

154. Rappsilber J. h £p. Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome. // Genome research. 2002. T. 12. № 8. C. 1231-45.

155. Redlich G. h zip. Distinction between human cytochrome P450 (CYP) isoforms and identification of new phosphorylation sites by mass spectrometry. // Journal of proteome research. 2008. T. 7. № 11. C. 4678-88.

156. Reid G.E., McLuckey S.A. "Top down" protein characterization via tandem mass spectrometiy. // Journal of mass spectrometry: JMS. 2002. T. 37. № 7. C. 663-75.

157. Rodriguez C. h zip. Proteotyping of human haptoglobin by MALDI-TOF profiling: Phenotype distribution in a population of toxic oil syndrome patients. // Proteomics. 2006. T. 6. C. S272--81.

158. Roher A. h zip. Structural alterations in the peptide backbone of beta-amyloid core protein may account for its deposition and stability in Alzheimer"s disease // J. Biol. Chem. 1993. T. 268. № 5. c. 3072-3083.

159. Rostami-Hodjegan A., Tucker G.T. Simulation and prediction of in vivo drug metabolism in human populations from in vitro data. // Nature reviews. Drug discovery. 2007. T. 6. № 2. C. 140-8.

160. Roth M.J. h zip. "Proteotyping": population proteomics of human leukocytes using top down mass spectrometry. // Analytical chemistry. 2008. T. 80. № 8. C. 285766.

161. Rozman D., Waterman M.R. Lanosterol 14alpha -Demethylase (CYP51) and Spermatogenesis // Drug Metab. Dispos. 1998. T. 26. № 12. C. 1199-1201.

162. Rubina A.Y. h zip. Why 3-D? Gel-based microarrays in proteomics. // Proteomics. 2008. T. 8. №4. C. 817-31.

163. Sadygov R.G., Cociorva D., Iii J.R.Y. Large-scale database searching using tandem mass spectra: Looking up the answer in the back of the book // Nature Methods. 2004. T. 1. № 3. C. 195-202.

164. Sarkozy A. h zip. Germline BRAF mutations in Noonan, LEOPARD, and cardiofaciocutaneous syndromes: molecular diversity and associated phenotypic spectrum. // Human mutation. 2009. T. 30. № 4. C. 695-702.

165. Sattelle D.B., Jones A.K., Buckingham S.D. Insect genomes: challenges and opportunities for neuroscience. // Invertebrate neuroscience: IN. 2007. T. 7. № 3. C. 133-6.

166. Schandorff S. h ,np. A mass spectrometry-friendly database for cSNP identification. //Nature methods. 2007. T. 4. № 6. C. 465-6.

167. Schmuth M. h Ichthyosis update: towards a function-driven model of pathogenesis of the disorders of cornification and the role of corneocyte proteins in these disorders. //Advances in dermatology. 2007. T. 23. C. 231-56.

168. Schweigert F.J., Wirth K., Raila J. Characterization of the microheterogeneity of transthyretin in plasma and urine using SELDI-TOF-MS immunoassay. // Proteome science. 2004. T. 2. № 1. C. 5.

169. Searle B.C., Turner M., Nesvizhskii A.I. Improving sensitivity by probabilistically combining results from multiple MS/MS search methodologies. // Journal of proteome research. 2008. T. 7. № 1. C. 245-53.

170. Seo J., Lee K.-J. Post-translational modifications and their biological functions: proteomic analysis and systematic approaches. // Journal of biochemistry and molecular biology. 2004. T. 37. № 1. C. 35-44.

171. Sherry S.T. dbSNP: the NCBI database of genetic variation // Nucleic Acids Research. 2001. T. 29. № 1. C. 308-311.

172. Shevchenko A. h j\p. Mass Spectrometric Sequencing of Proteins from Silver-Stained Polyacrylamide Gels // Analytical Chemistry. 1996. T. 68. № 5. C. 850858.

173. Shi W.-feng h up. Proteotyping: A new approach studying influenza virus evolution at the protein level // Virologica Sinica. 2008. T. 22. № 5. C. 405-411.

174. Shteynberg D. h np. iProphet: Multi-level integrative analysis of shotgun proteomic data improves peptide and protein identification rates and error estimates. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2011. C. Ml 11.007690-.

175. Smigielski E.M. dbSNP: a database of single nucleotide polymorphisms // Nucleic Acids Research. 2000. T. 28. № 1. C. 352-355.

176. Srebrow A., Kornblihtt A.R. The connection between splicing and cancer. // Journal of cell science. 2006. T. 119. № Pt 13. C. 2635-41.

177. Stamm S. h zip. ASD: a bioinformatics resource on alternative splicing. // Nucleic acids research. 2006. T. 34. № Database issue. C. D46-55.

178. Stein P.E., Carrell R.W. What do dysfunctional serpins tell us about molecular mobility and disease? // Nature Structural Biology. 1995. T. 2. № 2. C. 96-113.

179. Supek F. n zip. Enhanced analytical power of SDS-PAGE using machine learning algorithms. //Proteomics. 2008. T. 8. № 1. C. 28-31.

180. Taylor C.F. Minimum reporting requirements for proteomics: a MIAPE primer. // Proteomics. 2006. T. 6 Suppl 2. C. 39-44.

181. Taylor C.F. h zip. The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE). // Nature biotechnology. 2007. T. 25. № 8. C. 887-93.

182. Thiede B. h zip. Peptide mass fingerprinting. // Methods (San Diego, Calif.). 2005. T. 35. № 3. C. 237-47.

183. Tsvetkov P.O. h zip. Isomerization of the Asp7 residue results in zinc-induced oligomerization of Alzheimer"s disease amyloid beta(l-16) peptide. // Chembiochem: a European journal of chemical biology. 2008. T. 9. № 10. C. 1564-7.

184. Uhlen M. h zip. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2005. T. 4. № 12. C. 1920-32.

185. Ullrich A. h zip. CANCER-RELATED PROTEIN KINASES // US Patent App. 12/. 2007.

186. Venter J.C. h zip. The sequence of the human genome. // Science (New York, N.Y.). 2001. T. 291. № 5507. C. 1304-51.

187. Vizcaino J.A., Foster J.M., Martens L. Proteomics data repositories: Providing a safe haven for your data and acting as a springboard for further research // Journal of Proteomics. 2010. C. 1-11.

188. W Vogel K. h zip. Developing assays for kinase drug discovery where have the advances come from? // 2007.

189. Westlind-Johnsson A. Comparative analysis of CYP3A expression in human liver suggests only a minor role for CYP3A5 in drug metabolism // Drug Metabolism and Disposition. 2003. T. 31. № >6. C. 755-761.

190. Wheeler D.L. h zip. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. //Nucleic acids research. 2007. T. 35. № Database issue. C. D5-12.

191. Whibley C., Pharoah P.D.P., Hollstein M. p53 polymorphisms: cancer implications. //Nature reviews. Cancer. 2009. T. 9. № 2. C. 95-107.

192. Wilkins M.R. h /ip. From Proteins to Proteomes: Large Scale Protein Identification by Two-Dimensional Electrophoresis and Amino Acid Analysis // Bio/Technology. 1996. T. 14. № 1. C. 61-65.

193. Wu C.H. h ap. The Universal Protein Resource (UniProt): an expanding universe of protein information. // Nucleic acids research. 2006. T. 34. № Database issue. C. D187-91.

194. Yates J R., Eng J.K., McCormack A.L. Mining Genomes: Correlating Tandem Mass Spectra of Modified and Unmodified Peptides to Sequences in Nucleotide Databases // Analytical Chemistry. 1995. T. 67. № 18. C. 3202-3210.

195. Yip Y.L. h Annotating single amino acid polymorphisms in the UniProt/Swiss-Prot knowledgebase. // Human mutation. 2008. T. 29. № 3. C. 3616.

196. Zanger U.M. h ap. Polymorphic CYP2B6: molecular mechanisms and emerging clinical significance. //Pharmacogenomics. 2007. T. 8. № 7. C. 743-59.

197. Zgoda V.G. h £p. Proteomics of mouse liver microsomes: performance of different protein separation workflows for LC-MS/MS. // Proteomics. 2009. T. 9. № 16. C. 4102-5.

198. Zhou H. h ap. Quantitative proteome analysis by solid-phase isotope tagging and mass spectrometry. //Nature biotechnology. 2002. T. 20. № 5. C. 512-5.

199. Zubarev R.A., Zubarev A.R., Savitski M.M. Electron capture/transfer versus collisionally activated/induced dissociations: solo or duet? // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2008. T. 19. № 6. C. 753-61.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.

Рассматриваемые вопросы:
Методы выделения органелл и мембран из тканей, клетки.
Этапы субклеточного фракционирования: экстракция,
гомогенизация и центрифугирование, их особенности.
Методы разделения и очистки субклеточных компонентов.
Выделение мембранных частиц.
Идентификация мембранных фракций, критерии их очистки.
Контроль наличия примесей с помощью световой и
электронной микроскопии, анализа липидного состава или
определении активности маркерных ферментов.
Определение белкового состава в выделяемых мембранных
фракциях. Определение активности маркерных ферментов
определенного типа выделенной мембранной фракции.

Получение отдельных клеточных компонентов дает возможность изучать
их биохимию и функциональные особенности. Например, можно создать
бесклеточную систему для рибосом, которые будут синтезировать белок
по заданной экспериментатором информационной РНК. Выделенные
митохондрии в подобранных условиях могуг осуществлять синтез АТФ, на
выделенном хроматине при участии соответствующих ферментов может
происходить синтез РНК и т.д.
В последнее время применяются бесклеточные системы для воссоздания
клеточных надмолекулярных структур. Так, используя очищенные от
гранул желтка экстракты цитоплазмы яиц земноводных или яиц морских
ежей, можно получить ядра с ядерной оболочкой из введенной в эту
бесклеточную систему чужеродной ДНК (например, ДНК бактериофага).
Такая ДНК связывается с белками-гастонами, которые есть в избытке в
таком экстракте, образуется хроматин (дезоксирибонуклеопротеид),
который покрывается двойной мембранной оболочкой, несущей даже
ядерные поры. Такие модельные системы помогают изучать тонкие,
интимные процессы, например транспорт макромолекул из цитоплазмы в
ядро, и наоборот. В цитоплазматических экстрактах яиц земноводных и
иглокожих такие ядра могут периодически делиться путем митоза. Эти
модели внесли огромный вклад в расшифровку природы регуляции
клеточного цикла.

Для того чтобы выделить клеточные органеллы,
исследуемый образец измельчают и
затем гомогенизируют в забуференной среде с
использованием гомогенизатора Поттера-Элведжема
(тефлоновый пестик, вращающийся в стеклянном
цилиндре). Это сравнительно мягкий метод, который
особенно предпочтителен для выделения лабильных
молекул и ультраструктур. Другие методики разрушения
клеток включают ферментативный лизис, разрушающий
клеточные стенки, или механическое разрушение
замороженных тканей (размолом или с помощью
вращающихся ножей; под большим давлением;
осмотическим шоком; многократным чередованием
замораживания и оттаивания).

Для выделения интактных органелл важно, чтобы среда, в которой
проводится гомогенизация, была изотонической, т.е.
осмотическое давление буфера должно соответствовать давлению
внутри клетки. Если раствор гипотоничен, органеллы будут
«впитывать» дополнительную воду и лопнут, а в
гипертонических растворах они, напротив, сморщиваются.
Вслед за гомогенизацией следует фильтрование для удаления
интактных клеток и соединительных тканей. Собственно
фракционирование клеточных органелл проводится с помощью
дифференциального центрифугирования, т.е. центрифугирования
при различных скоростях вращения ротора. При этом ступенчатое
увеличение центробежной силы (которую принято выражать
величиной, кратной нормальному ускорению свободного падения g
= 9,81 м/с2) приводит к последовательному осаждению различных
органелл, т.е. их разделению в соответствии с плотностью и
размером.

Одним из основных способов выделения клеточных структyp является
дифференциальное (разделительное) центрифугирование. Принцип его
применения в том, что время осаждения частиц в гомогенате зависит от их
размера и плотности: чем больше частица или чем она тяжелее, тем быстрее
она осядет на дно пробирки. Для убыстрения процесса оседания варьируют
ускорения, создаваемые центрифугой.
При центрифугировании раньше всего и при небольших ускорениях осядут ядра
и неразрушенные клетки, при 15-30 тыс. g осядут крупные частицы,
макросомы, состоящие из митохондрий, мелких пластид, пероксисом,
лизосом и др., при 50 тыс. g осядут микросомы, фрагменты вакуолярной
системы клетки.
При повторном дробном центрифугировании этих смешанных подфрак-ций
можно получить чистые фракции. Так, при разделении макросомной
подфракции получают отдельно митохондрии, лизосомы, пероксисомы. При
разделении микросом можно получить фракцию мембран аппарата Гольджи,
фрагментов плазматической мембраны, вакуолей, гранулярного ретикулума. В
случаях более тонкого разделения фракций используют центрифугирование в
градиенте плотности сахарозы, что позволяет хорошо разделить компоненты,
даже незначительно отличающиеся друг от друга по удельной массе.

Выделение клеточных органелл обычно проводят при низких
температурах (0-5°С) для того, чтобы уменьшить степень
деградации материала за счет реакций, катализируемых
ферментами; последние высвобождаются в процессе разрушения
ткани. Добавление тиолов и хелатирующих агентов необходимо для
защиты функциональных SH-групп от окисления.
Прежде чем выделенные фракции анализировать биохимическими
способами, необходимо проверить их на чистоту с помощью
электронного микроскопа.
Получение отдельных клеточных компонентов дает возможность
изучать их биохимию и функциональные особенности. Так можно
создать бесклеточную систему для рибосом, которые будут
синтезировать белок по заданной экспериментатором
информационной РНК. Выделенные митохондрии в подобранных
условиях могуг осуществлять синтез АТФ, на выделенном хроматине
при участии соответствующих ферментов может происходить
синтез РНК и т.д.

Основы метода центрифугирования
Частицы в растворе осаждаются (седиментация),
когда их плотность выше плотности раствора, или
всплывают (флотация), когда их плотность ниже
плотности раствора. Чем больше разница в
плотности, тем быстрее идет распределение частиц.
Когда плотности частиц и раствора одинаковые
(изопикнические условия), частицы остаются
неподвижными. При малой разнице в плотности
частицы можно разделить только в центрифуге,
которая создает центробежную силу, во много раз
превышающую силу земного притяжения.

соотношение между плотностью и коэффициентом седиментациидля
различных частиц в растворе хлорида цезия (CsCI).

Скорость седиментации частицы (ν) зависит от угловой
скорости (ω), эффективного радиуса ротора rэфф(расстояние от
оси вращения) и седиментационных свойств частиц.
Седиментационные свойства частицы
характеризуются коэффициентом седиментации S и
выражаются в единицах Сведберга (1S = 10-13с).
Величина S может колебаться в широких пределах. Для
сравнения коэффициентов седиментации в различных средах
их обычно корректируют по плотности и вязкости водыпри
20oC (S20w).
Коэффициент седиментации зависит от молекулярной массы
(М) частицы, ее формы (коэффициент трения f),
парциального удельного объема ΰ (величина, обратная
плотности частицы).

Центрифугирование в градиенте плотности
Макромолекулы или органеллы, незначительно различающиеся по размеру или по плотности,
можно разделитьцентрифугированием в градиенте плотности. Для этих целей используются два
метода.
При зональном центрифугировании анализируемая проба (например, белки или клетки)
наслаивается тонким слоем поверх буферного раствора. В процессе центрифугирования частицы
проходят через раствор, так как их плотность выше плотности раствора. Скорость движения
зависит от массы и формы частиц (см. формулы на схемеА). Центрифугирование прекращают
прежде, чем частицы достигнут дна центрифужной пробирки. Затем дно прокалывают и
собирают ряд фракций, содержащих различные частицы. Стабильность градиента плотности в
процессе центрифугирования достигается применением растворов углеводов или коллоидного
силикагеля,концентрация которых возрастает от поверхности к дну пробирки. Градиент плотности
препятствует образованию конвекционных потоков, снижающих качество разделения.
При изопикническом центрифугировании пробу (например ДНК, РНК или вирусы) равномерно
распределяют во всем объеме раствора (обычно CsCI). В этом случае разделение продолжается
значительно дольше, чем при зональном центрифугировании. Градиент плотности создается в
процессе центрифугирования за счет седиментациии диффузии. Со временем каждая частица
попадает в область, соответствующую ее собственной плавучей плотности. Центрифугирование
прекращают, когда устанавливается равновесие. Полученные фракции анализируют, используя
подходящую измерительную технику.

Молекулы-маркеры
В процессе фракционирования важно
контролировать чистоту фракций. Присутствие
в определенной фракции той или иной
органеллы и наличие других компонентов
определяют с помощью молекул-маркеров.
Обычно это органеллоспецифичные
ферменты (ферменты-маркеры).
Распределение ферментов-маркеров в клетке
отражает локализацию в ней
соответствующих каталитических реакций.

Функции и состав биомембран
Наиболее важными мембранами в животных клетках
являются плазматическая мембрана, внутренняя и
внешняя ядерные мембраны, мембраны
эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи
, внутренние и внешние митохондриальные
мембраны. Лизосомы, пероксисомы, различные
везикулы также отделены от цитоплазмымембранами
. Клетки растений содержат дополнительно мембраны
хлоропластов, лейкопластов и вакуолей. Все
мембраны полярны, т.е. существует различие в
составах внутреннего и внешнего по отношению к
цитоплазме слоев.

Биомембраны и их составляющие выполняют следующие функции:
1. Ограничение и обособление клеток и органелл. Обособление клеток от межклеточной
среды обеспечиваетсяплазматической мембраной, защищающей клетки от
механического и химического воздействий. Плазматическая мембрана обеспечивает
также сохранение разности концентраций метаболитов и неорганических ионов между
внутриклеточной и внешней средой.
2. Контролируемый транспорт метаболитов и ионов определяет внутреннюю среду, что
существенно для гомеостаза, т.е. поддержания постоянной концентрации метаболитов и
неорганических ионов, и других физиологических параметров. Регулируемый и
избирательный транспорт метаболитов и неорганических ионов через поры и
посредством переносчиков становится возможным благодаря обособлению клеток и
органелл с помощью мембранных систем.
3. Восприятие внеклеточных сигналов и их передача внутрь клетки, а также инициация
сигналов.
4. Ферментативный катализ. В мембранах на границе между липидной и водной фазами
локализованы ферменты. Именно здесь происходят реакции с неполярными
субстратами. Примерами служат биосинтез липидов и метаболизмнеполярных
ксенобиотиков. В мембранах локализованы наиболее важные реакции энергетического
обмена, такие, как окислительное фосфорилирование (дыхательная цепь) и фотосинтез.
5. Контактное взаимодействие с межклеточным матриксом и взаимодействие с другими
клетками при слиянии клетоки образовании тканей.
6. Заякоривание цитоскелета, обеспечивающее поддержание формы клеток и органелл
и клеточной подвижности.

После гомогенизации образца, центрифугирования гомогената с
разной скоростью получают отдельные фракции, содержащие
клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также
надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые
белки цитозоля клетки.
Экстракция белков, связанных с мембранами, и разрушение
олигомерных белков на протомеры
Если искомый белок прочно связан с какими-либо структурами
клетки, его необходимо перевести в раствор.
Для разрушения гидрофобных взаимодействий между белками
и липидами мембран в раствор добавляют детергенты: Чаще
всего используют тритон Х-100 или додецилсульфат натрия.
При действии детергентов обычно разрушаются и гидрофобные
взаимодействия между протомерами в олигомерных белках

Удаление из pacтвopa небелковых веществ
Нуклеиновые кислоты, липиды и Другие
небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их особенные физикохимические
свойства. Так, липиды легко
удаляются
из
раствора
добавлением
органических
растворителей,
например
ацетона. Однако воздействие должНо бытЬ
кратковременным. так как ацетон вызывает
денатурацию некоторых белков. Нуклеиновые
кислоты осаждают добавлением в раствор
стрептомицина.

Выделение липидов мембран осуществляют сразу после получения мембранной
фракции, которую необходимо защищать от действия протео- и липолитических
ферментов, автоокисления.
Обычно все процедуры проводят при низкой температуре, поддерживая определенные
значения pH и ионной силы. Для экстракции липидов используют смесь хлороформ-
метанол. Для одновременной экстракции белков и липидов из теней эритроцитов их
экстрагируют смесью бутанол-вода. При этом большая часть белков переходит в
водный, а липида в бутанольный слой.
Количественный анализ сложных смесей фосфолипидов проводят
хроматографическими методами. Для препаративных целей в основном используют
хроматографию на колонках. Для микроаналитических исследований успешно
применяют тонкослойную хроматографию, с помощью которой можно разделить
практически все классы липидов, локализовать и идентифицировать их при
использовании специальных реактивов.
По элюирующей способности растворители располагаются в следующем
возрастающем порядке петролейный эфир, цикло-гексан, четыреххлористый углерод,
толуол, бензол, хлороформ, диэтиловый эфир, этилацетат, ацетон, н-пропанол,
этанол, метанол, вода. После пропускания растворителей пластинку высушивают на
воздухе и идентифицируют липиды с помощью окрашивания специфическими
реагентами. Для количественного определения фосфолипидов, разделенных
тонкослойной хроматографией, используют спектрофотометрические методы.

Исследования мембран в значительной
мере базируются на двух основных
методических приемах: это разборка
нативной (то есть природной) мембраны на
составляющие ее элементы и последующая
полная или частичная сборка искусственной
мембраны с использованием всех или
части компонентов исходной мембраны.
Применительно к мембранам эти приемы
получили название "солюбилизация" и
"реконструкция».

Для солюбилизации лучше использовать детергенты с
низкой ККМ, так как такие детергенты легче
встраиваются в мембрану и быстрее вызывают ее
распад до смешанных мицелл. В этом качестве
наиболее эффективны ионные детергенты.
В качестве параметров, характеризующих способность
детергентов к мицеллообразованию, обычно
используют критическую концентрацию
мицеллообразования (ККМ) и число агрегации. ККМ –
это та концентрация, при которой детергент начинает
образовывать мицеллы. До этого он находится в воде
в мономерной форме в состоянии истинного
раствора. Число агрегации показывает, сколько
молекул детергента приходится на одну мицеллу.

Чаще всего используются четыре основных способа удаления
детергента: диализ, гель-фильтрация, сильное разбавление
солюбилизата и адсорбция детергента на гидрофобных полимерах.
Более быстрый способ основан на удалении детергента с помощью
гель-фильтрации, когда солюбилизат пропускают через инертный
гель, размер пор которого достаточно велик, чтобы удержать
молекулы детергента, но мал по сравнению с образующимися
мембранными частицами, которые свободно проходят между
гранулами геля.
С максимальной полнотой детергент может быть удален из мембраны
путем его адсорбции на гидрофобных полимерах. Этот способ
особенно хорош для удаления остаточных количеств детергента из
уже сформировавшихся мембранных частиц. Однако для удаления
детергента из исходного солюбилизата он малопригоден, так как на
начальных стадиях реконструкции удаление детергента может
сопровождаться адсорбцией значительных количеств белка и липида
на полимере. Поэтому обычно этот метод используют в комбинации с
другими способами на конечной стадии удаления детергента.

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Кайшева, Анна Леонидовна. Масс-спектрометрическая идентификация белков и белковых комплексов на чипах атомно-силового микроскопа: диссертация... кандидата биологических наук: 03.01.04 / Кайшева Анна Леонидовна; [Место защиты: Науч.-исслед. ин-т биомед. химии им. В.Н. Ореховича РАМН].- Москва, 2010.- 104 с.: ил. РГБ ОД, 61 10-3/1308

Введение

Глава 1. Обзор литературы 10

1.1. Анализ научно-технического задела в области высокочувствительных протеомных технологий

1.2 Характеристика вируса гепатита С 20

1.2.1 Методы диагностики гепатита С 22

1.2.2 Серологические белковые маркеры гепатита С 25

Глава 2. Материалы и методы 28

2.1 АСМ-чипы 28

2.2 Препараты белков и реактивы 29

2.3 АСМ-анализ 30

2.4 Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа 31

2.5 Масс-спектрометрический анализ 33

2.5.1 МАЛДИ-МС-анализ белков на поверхности АСМ-чипа 33

2.5.2 ЭСИ-МС-анализ белков на поверхности АСМ-чипа 34

Глава 3. Результаты и их обсуждение 35

3.1 МС -идентификация белков, выловленных с помощью «химического фишинга» на поверхность АСМ-чипа из раствора аналита

3.2 МС-идентификация белков, биоспецифически выловленных на поверхности АСМ-чипа из раствора аналита

3.3 МС-идентификация белков на поверхности АСМ-чипа, биоспецифически выловленных из образцов сыворотки крови

Заключение 83

Литература

Введение к работе

Актуальность работы.

Одним из приоритетных направлений в современной биохимии является создание эффективных аналитических методов для протеомного анализа, главная задача которых заключается в обнаружении и инвентаризации белков организма, исследовании их структуры, функций, выявлении белковых взаимодействий. Решение данной задачи позволит создать новые системы диагностики заболеваний и их лечения. Стандартные методы современного протеомного анализа базируются на разделении многокомпонентных белковых смесей с помощью хроматографии, электрофореза в комбинации с масс-спектрометрическими методами (МС) идентификации белков. При несомненном достоинстве стандартного МС-анализа в плане быстродействия и достоверности идентификации белковых молекул, он обладает существенными ограничениями применения, обусловленными низкой

концентрационной чувствительностью анализа на уровне 10" "10" М и высоким динамическим диапазоном содержания белков в биологическом материале. В то же время подавляющее количество функциональных белков, в том числе биомаркеры таких социально-значимых заболеваний, как вирусные гепатиты В и С, онкомаркеры и др., присутствуют в плазме крови в области концентраций 10" Ми менее.

Один из путей преодоления такого методологического ограничения концентрационной чувствительности анализа заключается в использовании биомолекулярных детекторов, которые позволяют регистрировать единичные молекулы и их комплексы и теоретически не имеют ограничений концентрационной чувствительности. К биомолекулярным детекторам относятся детекторы на базе нанотехнологических устройств, таких как атомно-силовые микроскопы (АСМ), нанопроводные детекторы, нанопоры и ряд других детекторов. Уникальная чувствительность АСМ-детекторов позволяет визуализировать отдельные молекулы белков и подсчитывать их количество. При использования АСМ в качестве биомолекулярного детектора необходимо применение специальных чипов, позволяющих сконцентрировать биологические макромолекулы аналита из большого объема инкубационного раствора на ограниченной поверхности чипа. Исследуемые белковые объекты могут быть сконцентрированы на поверхности чипа как за счет физической или химической адсорбции, так и за счет биоспецифических взаимодействий (АСМ-биоспецифический фишинг).

Однако на практике ограничение применения нанодетекторов на базе АСМ заключается в том, что несмотря на возможность визуализации отдельных белковых молекул на поверхности чипа, такие детекторы не способны идентифицировать их, что особенно важно в исследовании сложных белковых смесей, в том числе биологического материала. Поэтому разработка метода анализа, дополняющего возможности метода АСМ, представляется актуальной задачей. На сегодняшний день единственным протеомным методом, позволяющим однозначно и достоверно идентифицировать белковые молекулы, является МС-анализ. В диссертационной работе разработан подход, объединяющий высокую чувствительность метода АСМ и достоверную МС-идентификацию для детекции белков и их комплексов из раствора аналита.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в масс-спектрометрической идентификации белков и белковых комплексов, выявленных в биоматериале с помощью атомно-силовой микроскопии.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

Разработана схема МС-идентификации белков, выловленных на поверхность АСМ-чипа с помощью химического или биоспецифического фишинга;

Разработаны условия ферментативного гидролиза белков на поверхности АСМ-чипа для последующей МС-идентификации;

Проведена МС-идентификация модельных белков на поверхности АСМ-чипа;

Проведена МС-идентификация белков на поверхности АСМ-чипа, биоспецифически выловленных из многокомпонентной смеси (сыворотки).

Научная новизна работы .

В диссертации разработана схема, позволяющая проводить МС-идентификацию белков и белковых комплексов, выловленных из раствора или многокомпонентной смеси на поверхности АСМ-чипа. Для этого были подобраны оптимальные условия подготовки образцов, в том числе режим проведения гидролиза (температурный режим, влажность, состав трипсинолитической смеси, время трипсинолиза) белковых молекул, ковалентно и нековалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипа. Особенность настоящей работы заключалась в том, что по сравнению со стандартными протеомными протоколами ферментативного гидролиза подготовка образцов для МС-анализа проводилась не в растворе, а на ограниченной площади

поверхности чипа. Разработанная схема позволила эффективно провести МС-анализ и идентифицировать на поверхности АСМ-чипа как отдельные белки, так и белковые комплексы. МС-анализ протеотипических пептидов исследуемых белков проводился с использованием двух типов ионизации {MALDI и EST) и двух типов детекторов (времяпролетного и типа ионная ловушка). Разработанная схема сопряжения АСМ-биоспецифический фишинг и МС также была успешно апробирована для детекции белковых маркеров вирусного гепатита С (ВГС) (HCVcoreAg и Е2) в образцах сыворотки крови.

Практическая значимость работы .

Результаты данной работы дают возможность создания высокочувствительных протеомных методов без использования меток и дополнительных процедур подготовки образцов для обнаружения белков, находящихся в биологическом материале в низкой концентрации, в том числе в сыворотке крови. Предложен подход на основе атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии, который позволит выявлять и идентифицировать белковые маркеры вируса гепатита С в сыворотке крови человека.

Подход может быть использован в разработках, направленных на создание новых диагностических чипов, поиск биомаркеров широкого диапазона социально-значимых заболеваний.

Апробация работы.

Основные результаты исследования были представлены на «1-м, 2-м и 3-м Международном форуме по нанотехнологиям» (Москва, 2008-2010); «IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, 2008; на Международной конгрессе «Протеом человека», Амстердам, 2008; на Международной конгрессе «Протеом человека», Сидней, 2010.

Публикации.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 104 страницах, иллюстрирована 33 рисунками и 4 таблицами, список литературы состоит из 159 наименований.

Анализ научно-технического задела в области высокочувствительных протеомных технологий

Одним из приоритетных направлений в современной науке является обнаружение и выяснение роли различных типов белков в организме, а также понимание молекулярных механизмов, приводящих к развитию заболеваний.

Несмотря на постоянное совершенствование протеомных методов, количество вновь открытых биомаркеров заболеваний остается практически / неизменным за последнее десятилетие . Это связано с тем, что концентрационный предел детекции традиционных протеомных методов не превосходит 10"9 М . В то же время важным для протеомики является разработка новых аналитических подходов идентификации белков более низкого концентрационного диапазона, в частности низкокопийных белковых молекул (с концентрацией 10"13 М и менее), в том числе биомаркеров в биологическом материале. Поскольку можно предполагать, что именно в этих концентрационных диапазонах находятся белковые маркеры большинства заболеваний .

Одно из активно развивающихся направлений, позволяющее, несколько повысить концентрационную чувствительность анализа, заключается в создании аналитических комплексов на основе нанохроматографических и наноэлектрофоретических систем, совместимых с масс-спектрометрами.

Нанохроматографическая система в комбинации с масс-спектрометрией и электроспрейным типом ионизации- позволили повысить чувствительность выявления белков на два порядка по сравнению с хроматографией высокого разрешения (ВЭЖХ) . Предел концентрационной чувствительности таких сопряженных систем ограничен чувствительностью стадии электрофореза/хроматографии, и не превосходит 10"12 М для отдельных белков (например, для цитохрома С и брадикинина) .

В настоящее время хроматографические методы развились в отдельные самостоятельные направления - SELDI МС анализ {surface enhanced laser desorption and ionization/time of flight mass spectrometry) , методы фишинга белков с использованием магнитных микрочастиц . В этих технологиях, гидрофобные или заряженные поверхности SELDI-чипов -. или магнитных микрочастиц в, комбинации с масс-спектрометрическим анализом, успешно используются: для? выявления- и идентификации, как отдельных типов; белков, так и для белкового/пептидного профилирования сыворотки крови [в, 8; \Ъ, 15]. SEbDIi МЄ представляет собой: мощный подход, позволяющий исследовать биоматериал за- счет адсорбции биомолекул (белковj. пептидов) на химически активированную? поверхность (катионо-/анионообменные чипы) с последующим масс-спектрометрическим анализом адсорбированных: молекул:. SEEDPМЄ подход применяется; для-белкового- профилирования биоматериала;. а в последнее время: стал использоваться в качестве «диагностики,по протеомным штрих-кодам» [ 17].. Суть такой «штрих-кодовой диагностики» заключается в выявлении? особенностей белкового профиля биологического образца; связанных с определенным заболеванием: Так, известно; что г при. раковых заболеваниях «протеомный штрих-код» бйоматериала- значительно отличается от такого у здоровых1 групп» лиц: Поэтому, контроль над изменением белкового; состава биоматериала может стать основой для раннешдиагностики заболеваний. На; сегодняшний день, с помощью подхода SELDI? МЄ были выявлены маркеры. рака желудка, яичников, простаты, и молочной железы : Ограничение этого метода5 заключается вь невозможности идентифицировать белки с высоким разрешением и достоверностью, что особенно важно при; анализе многокомпонентных смесей, таких как биологическийгматериал.

Помимо проблемы низкой концентрационной чувствительности существующих аналитических систем, камнем преткновения для протеомного анализа биологического материала стал широкий динамический диапазон концентраций белков, особенно в сыворотке крови, который варьирует от 1(Г М вплоть до отдельных белковых молекул. Высококопийные (мажорные) белки препятствуют в таких системах выявлению и идентификации низкокопийные (минорных) белков .

Проблему широкого концентрационного диапазона белков в биоматериале возможно решить путем применения методов обеднения сыворотки крови от мажорных фракций белков, методов сепарации многокомпонентных смесей и нанотехнологических методов, основанных на биоспецифическом и химическом фишинге белковых молекул аналита из сложных смесей на поверхность чипов к различным биосенсорам или на активированную поверхность магнитных микросфер .

Традиционно для разделения многокомпонентных белковых смесей используют одномерный, чаще двумерный гель-электрофорез . Принцип разделения белков методами- двумерного гель-электрофореза основан на различии белков по значениям их изоэлектрических точек Hf молекулярных масс . В протеомике данные подходы применяются для белкового картирования биоматериала (ткань, плазма крови и др.) . Комбинация одномерного и/или двумерного электрофореза с масс-спектрометрией позволяет идентифицировать разделенные и визуализированные белки . Однако процедура двумерного гель-электрофореза до сих пор не автоматизирована, достаточно, сложна и трудоемка в исполнении, требует высокой квалификации оператора, а результаты анализа зачастую плохо воспроизводимы .

Более удобная по сравнению, с двумерным электрофорезом процедура разделения белков - это хроматография высокого разрешения (ВЭЖХ); которая представляет собой автоматизированную процедуру, позволяющую удалять высококопийные белки из сложной смеси с целью последующего выявления низкокопийных белков .

С целью прямой идентификации белков в сложных смесях, хроматографическая колонка может быть соединена с масс-спектрометром. Однако интактные белки практически не поддаются высококачественному разделению с помощью ВЭЖХ, поскольку денатурируют при проведении анализа (из-за низких значений рН среды и высокой- концентрации органических растворителей), а также вследствие низкой точности масс-спектрометрического анализа, поэтому, прямая идентификация большинства интактных белков, особенно с молекулярной массой превышающей 10 кДа, зачастую невозможна. Аналитическую точность измерения можно улучшить путем гидролитического расщепления белков до пептидных фрагментов, молекулярной массой от 700 до 4000 Да с помощью протеаз; таких как трипсин (технология "bottom-up"). Чтобы достигнуть качественного разделения белков в смеси, применяют- комбинацию нескольких хроматографических процедур, так называемая, многомерная хроматография .

Методы диагностики гепатита

В настоящее время для белковой диагностики гепатита С используются тест-системы на выявление анти-HCVcore. Первые ИФА-тесты, детектирующие наличие антител анти-HCVcore, стали доступны в начале 1990-х г., но они обладали низкой чувствительностью и селективностью. Позднее, в конце 90-х гг., появились ИФА-тесты на анти-HCVcore нового поколения, которые обладали достаточно высокой чувствительностью около 95-99% и могли выявлять ВГС спустя несколько месяцев после инфицирования .

Например, в 1996 г. на российском рынке появились тест-системы, разработанные в «Вектор-Бест» (Новосибирск) и «Диагностических системах» (Нижний Новгород) для выявления антител - анти-HCV класса IgM. Роль антител класса IgM в серодиагностике изучена недостаточно, однако некоторыми исследованиями показано значение данного маркера для выявления хронического гепатита С . Установлено также, что корреляция между выявлением РНК вируса и анти-HCV IgM у больных составляет 80-95% . Для определения фазы развития вирусного гепатита С Афанасьев А.Ю. с соавторами использовали коэффициент, отражающий отношение содержания в крови больных анти-HCV IgG к анти-HCV IgM . На сегодняшний день разработано множество систем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), которые обнаруживают циркулирующие антитела ко многим эпитопам,вируса гепатита Є.

Современная лабораторная диагностика: вирусного гепатита Є в большинстве лечебных учреждений г.. Москвы, осуществляется; в соответствии с существующими приказами Минздрава РФ и Департамента Здравоохранения: г. Москвы и заключается в определении иммуноглобулинов? класса G к вирусу гепатита Є (анти-HGV IgG) в сыворотке крови больных. Выявление данного маркера позволяет судить, о наличии текущешили перенесенной инфекции.

Недостатки методов;. детекции на основе EEISA, помимо, низкой чувствительности (более ГО"12 M)j обусловлены также ложной- детекцией; вирусного гепатита Є у пациентов- вследствие постинфекционного-иммунитета,., кросс-реактивности антител, а также недостаточной чувствительностью в. период острой) фазы BFG . BI СВЯЗИ? С: ЭТИМ продолжаются активные поиски; чувствительных, специфичных, быстрых и простых в исполнении методов детекции1маркеров «гепатита Є .

Другая- группа методов детекции, вирусного гепатита в сыворотке: крови заключается-ВІрегистрации;РНК ВЕЄ с помощью ПЦР; Определение РНК. BFG методами; ГЩР не может использоваться в качестве первичного теста для - подтверждения или исключения; диагноза; но; может быть; полезен для подтверждения диагноза: Диагностика1 BFG осуществляется посредством анализа 5 -некодируемого участка РНК. Однако результаты анализа варьируют.среди разных генотипов BFG.

На российском рынке появились биологические микрочипы, позволяющие проводить- генотипирование BFG и- определять, эффективную, схему противирусной; терапии. Данный биочип- представляет собой олигонуклеотидныйшикрочип для генотипирования BFG на основе анализа области NS5B. Полученные результаты свидетельствуют о способности биочипа идентифицировать все 6 генотипов и 36 подтипов ВГС, в том числе наиболее вирулентные и лекарственно устойчивые формы.

С одной стороны, методы ПЦР-анализа сверхчувствительны и позволяют детектировать и амплифицировать сигнал всего от одной молекулы РНК в образце, но с другой стороны, для этих методов характерны ложноположительные результаты вследствие случайной контаминации образцов, ложноотрицательные результаты из-за высокой мутируемости вируса и сравнительно высокая стоимость анализа. Даже у одного и того же человека уровень РНК ВГС может периодически изменяться более чем в миллиотраз, приводяк ложноотрицательным результатам, в случае низкой? репликации вируса или если вирус сохраняется в тканях, не попадая в кровь. Результаты количественного определения РІЖ, ВГС в.разных лабораториях недостаточно хорошо согласуются .

Особую ценность для ранней детекции вирусного гепатита С Bt биоматериале представляют белковые антигены ВГС в связи с тем, что появляются1 в сывороткекрови на несколько недель раньше, еще до-развития полноценного иммунного ответа организма.

Поверхностныйантиген HCVcoreAg вируса гепатита С является основным маркером инфицирования- вирусом, гепатита С. Он обнаруживается за 16 недель до появления антител в крови вследствие иммунного ответа организма и до развития клинических признаков, при этом- он регистрируются как в,острую, так и в хроническую фазы заболевания . Существует лишь один зарубежный коммерческий продукт («Ortho Clinical Diagnostics») ИФА-диагностики гепатита С в период острой фазы, основанный, на детекции HCVcoreAg.

Структурный белок HCVcoreAg, состоящий из 121 аминокислотного остатка, расположен на N-конце полипептида и образуется под воздействием клеточных протеаз . Первый протеолитический гидролиз происходит между остатками 191 и 192 (сайт С1) и-приводит к образованию гликопротеина Е1 . Второе место разрезания (С2) находится-между 174 и 191 аминокислотами.. Соответствующие продукты разрезания получили названия р21 и р23 . Анализ экспрессии в ряде клеток млекопитающих показал, что р21 является основным продуктом, а, р23 обнаруживается в минорных количествах. Возможно, что расщепление по сайтам С1 и С2 -взаимосвязанные процессы, поскольку р21 образуется в условиях, когда гидролиза по G2 не наблюдается [Г45]. HCVcoreAg представляет собой основные РНК-связывающий белок, который по-видимому, формирует вирусный нуклеокапсид. Биохимические- свойства этого- белка до сих пор плохо охарактеризованы. Исследования методом- АСМ" вирусных частиц гепатита С позволили получить изображение капсида HCV .

АСМ-чипы

В экспериментальной части работы использовались два типа АСМ-чипов. С помощью первого типа проводилась МС-идентификация модельных белков на поверхности АСМ-чипов. Эти чипы представляли собой подложки с функционально активными химическими группами, (далее называемые АСМ-чипы с химически активированной поверхностью), на которую были выловлены исследуемые молекулы и необратимо иммобилизованы за счет ковалентных связей, так называемая процедура «химического фишинга». Второй- тип АСМ-чипов использовался для МС-идентификации на- их поверхности белков, биоспецифически выловленных из,раствора аналита. На поверхности данных чипов- в- рабочих зонах, предварительно были иммобилизованы биологические зонды. В качестве биологических зондов использовались моноклональные антитела против- маркерных белков вирусных гепатитов В и.С (BFB и BFC) илиаптамерьр против белка gpl20 и тромбина. Для, процедуры биоспецифического-фишинга чипы с ковалентно иммобилизованными молекулами-зондами инкубировались. в% растворе аналита, содержащий только детектируемый белок, либо образцы сыворотки кровш

Для выполнения задачи МС-идентификации модельных белков, ковалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипов первого типа, в работе были использованы: авидин (Agilent, США), HSA (Agilent, США), Р450 ВМЗ (любезно предоставленный профессором А.В. Мунро, Манчестерский университет, Великобритания), тромбин (Sigma, США), a-FP и анти-a-FP (USBio, США); Для выполнения задачи МС-идентификации белков на поверхности АСМ-чипов второго типа, биоспецифически выловленных из раствора аналита, в качестве молекул-зондов использовались моноклональные антитела (МКА): анти-HCVcore (Virogen, США), анти-HBVcore (НИИ молекулярной диагностики, Москва), анти-HBsAg (Aldevron, США), в качестве молекул-мишени: HBVcoreAg, HCVcoreAg (Virogen, США) и HBsAg (Aldevron, США), gpl20 (Sigma, США), тропонин (USBio, США).

Кроме того, в работе использовались следующие вещества: ацетонитрил, изопропанол, муравьиная кислота, дистиллированная вода (Merck, США), трифторуксусная кислота (ТФУ), бикарбонат аммония (Sigma, США), а-циано-4-гидроксикоричнаЯі кислота (НССА), дигидроксибензойная кислота-(DHB) (Bruker Daltonics, Германия), трипсин (Promega, США).

Образцы сывороток крови для АСМ-исследованияг были предоставлены Кафедрой инфекционных- болезней у детей РГМУ, ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, МНИИЭМ" им. Габричевского: Наличие частиц вируса гепатита С (HCV) в, образцах сывороток крови подтверждалось с помощькь метода полимеразной{цепнойфеакции(ПЦР) с использованием тест-системы "Амплисенс HCV Монитор" (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва).

АСМ-анализ проводился в лаборатории нанобиотехнологии ИБМХ РАМН. Подсчет белков и комплексов антиген/антитело- на поверхности АСМ-чипа проводился на- основе соотнесения высот соответствующих изображений белков и их комплексов, измеренных с помощью- АСМ, согласно методике, изложенной в . Был использован» ACM NTEGRA (NT-MDT, Россия). АСМ-измерения проводились в полуконтактношмоде. В качестве зондов использовались кантилеверы фирмы NT-MDT серии NSG10. Типичный радиус кривизны игл составлял 10 нм, резонансная частота лежала в пределах от 190 до 325 кГц. Площадь сканирования чипа составляла 400 мкм2. Каждое измерение проводилось не менее 3 раз.

Иммобилизацию белков и аптамеров на поверхность АСМ-чипа проводили по следующей процедуре.

К белковому раствору (0,1 цМ) объемом 2 мкл добавляли 8 мкл раствора смеси NHS/EDC (v/v=l/l) и тщательно перемешивали. Полученную смесь наносили на поверхность силанизированного-чипа и инкубировали в течение 2 минут при комнатной температуре. Чип затем дважды промывали в термошейкере 1 мл деионизованной воды при 800 rpm и 37С. Качество иммобилизации.белков на поверхности АСМ-чипа контролировалось атомно-силовой микроскопией.

Иммобилизация аптамеров на химически активированную поверхность АЄМ-чипа проводилась следующим образом. К стоковому раствору DSP концентрацией 1,2 мМ в DMSO/этанол (v/v=l/l)4 добавляли раствор буфера PBS 50 мМ (рН 7.4,) также в соотношении 1/1 по объему. Полученный-таким образом рабочий раствор наносили, на поверхность АСМ-чипа и инкубировали в течение 10 минут. После чего проводили отмывку 50%-ным раствором-этанола в, воде объемом 1 мл при 15С в течение 10 минут. Раствор аптамера с концентрацией 3 JIM наносили на активированную зону АСМ-чипа и инкубировали в течение 4 минут и при перемешивании со скоростью 800 об./мин. Блокирование непрореагировавших аминогрупп кросс-линкера DSP осуществлялось в присутствии 5 мМ раствора Tris-HCl в течение 10 минут при 37С Заключительная стадия отмывки проводилась дважды водным раствором объемом 1 мл в течение 10 минут при 25С.

На поверхность АСМ-чипа с иммобилизованными молекулами-зондами наносилась трипсинолитическая смесь, содержащая буферный раствор 150 мМ NH4HCO3, ацетонитрил, 0,5 М гуанидин гидрохлорид, глицерол (рН 7,4). Затем к буферному раствору добавлялось 0,5 мкл раствора свиного модифицированного трипсина с концентрацией 0,1 мкМ. АСМ-чип инкубировался во влажной среде в течение 2 часов при постоянной температуре 45С, на его поверхность снова добавлялось 0,5 мкл раствора трипсина (0,1 мкМ), и инкубация продолжалась еще 12 часов. Трипсинолитическая смесь смывалась с поверхности АСМ-чипа раствором элюции объемом 10 мкл, содержащим 70% ацетонитрил в 0,7% трифторуксусной кислоте (ТФУ). Полученный таким образом с поверхности АСМ-чипа гидролизат высушивался в вакуумном испарителе при 45С и 4200 об./мин. Далее пептидная смесь растворялась в 10 мкл 5% раствора муравьиной кислоты или в 10 мкл 0,7% раствора ТФУ для проведения последующего МС-анализа.

При проведении МС-анализа с МАЛДИ-типом ионизации подготовка образцов осуществлялась следующим образом. Пробы, растворенные в 0,7% растворе ТФУ объемом 10 мкл, концентрировались и обессоливались с использованием микронаконечников ZipTip С18 (Millipore, США) в соответствии с протоколом производителя и смешивались с насыщенным раствором матрицы, содержащей НССА или DHB в 50% растворе ацетонитрила с 0,7% ТФУ. Полученную смесь наносили на МАЛДИ-мишень размера МТР.

-идентификация белков, выловленных с помощью «химического фишинга» на поверхность АСМ-чипа из раствора аналита

На данном этапе экспериментальной работы были получены МС-спектры для модельных белков, химически иммобилизованных на поверхности АСМ-чипов из раствора аналита. Диапазон концентраций исследуемых белков в растворе аналита для авидина, HSA, анти-aFP составлял 10" -10"9 М, тропонина, aFP и Р450 ВМЗ - 10"6-10"8 М.

МС-анализ проводился для 6 типов белков, различных по своему происхождению, молекулярной массе, количеству сайтов трипсинолиза и их пространственной доступности, степени гидрофобности аминокислотной последовательности (соотношение гидрофобных аминокислот к гидрофильным), которые были ковалентно иммобилизованы на поверхности АСМ-чипа из раствора аналита (таблица 1). В, данных экспериментах использовались АСМ-чипы, которые содержали рабочую и контрольную зоны. Рабочая зона являлась химически» активированной областью поверхности АСМ-чипа, на которой происходил «химический фишинг» модельных белков; контрольной зоной являлась химически неактивная область поверхности чипа. Подсчет визуализированных выловленных молекул регистрировали с помощью АСМ. Экспериментальные данные АСМ-анализа, полученные для вышеперечисленных модельных белков, а именно число молекул, выловленных на поверхности рабочей зоны АСМ-чипа, представлены в таблице 2. В колонке «концентрация белковых молекул в растворе» таблицы 2 приведены данные для минимально зарегистрированной концентрации соответствующего- белка в растворе аналита.

Как видно из таблицьг2, число молекул, зарегистрированных в рабочей зоне АСМ-чипа для всех представленных белков, составило -1040 молекул. Предел чувствительности МС-детекторов составляет около 105 молекул. Таким образом, для представленных модельных белков была проведена успешная необратимая иммобилизация на поверхности АСМ-чипа, и количества АСМ-зарегистрированных белковых объектов было достаточно для последующей МС-идентификации. При этом минимально зарегистрированная концентрация модельных белков в инкубационном растворе была при этом достаточно низкой 10" -10" М.

Масс-спектрометрический анализ образцов проводили с использованием МАЛДИ- и ЭСИ-типов ионизации. АСМ-чипа после инкубации в соответствующем растворе авидина с концентрацией 10"9 М. Анализ этих спектров позволил достоверно идентифицировать авидин {Gallus Gallus) по двум его протеотипическим пептидам: SSVNDIGDDWK (m/z=618,6) и VGINIFTR (m/z=460,4). Оба пептида имели хорошо выраженные пики своих двухзарядных ионов (МС-спектры). С помощью АСМ-МС анализа химически активированной рабочей зоны АСМ-чипа после инкубации в растворе белка аналита концентрацией 10"8 М был выявлен другой небольшой белок - тропонин I. Соответствующие пептидному двухзарядному иону 1449 Да МС- и МС/МС-спектры представлены на рисунке 3. МС-анализ экспериментально полученных спектров, позволил достоверно с вероятностью более 95% выявить и идентифицировать тропонин человека (gi 2460249) на поверхности АСМ-чипа.

На рисунке 5 представлены тандемные спектры фрагментации глобулярного белка - сывороточного альбумина человека (HSA), который выполняет в плазме крови транспортные функции. Спектры были получены с химически активированной рабочей зоны АСМ-чипа после инкубации в соответствующем- растворе альбумина с концентрацией 10"9 М. Анализ этих спектров позволил достоверно идентифицировать альбумин человека по двум его протеотипическим пептидам: VPQVSTPTLVEVSR (m/z=756,5) и YLYEIAR (m/z=464,3). Оба пептида имели хорошо выраженные пики своих двузарядных ионов (МС-спектры).

МС/МС спектры трипсинолизованных объектов с химически активированной поверхности АСМ-чипа, инкубированного в растворе сывороточного альбумина человека (С=10 9 М). Пептид VPQVSTPTLVEVSR с m/z=756,5 (А), пептид YLYEIAR с m/z=464,3 (Б). Экспериментальные условия: измерения были проведены на масс-спектрометре LC/MSD Trap ХСТ Ultra (Agilent).

Таким образом, МС-анализ позволил идентифицировать белки, обнаруженные с помощью АСМ. На основании- полученных данных была выявлена зависимость между числом идентифицированных протеотипических пептидов на поверхности АСМ-чипа и содержанием искомого белка в растворе аналита. Такая зависимость, например, для белков Р450 ВМЗ и HSA, ковалентно иммобилизованных на химически активированной поверхности АСМ-чипа, приведена на рисунке 6. Как видно на рисунке 6, чем выше концентрация белка в растворе аналита (-КГ6 М), тем большее число пептидов удается достоверно идентифицировать как в случае МАЛДИ-МС-, так и ЭСИ-МС-анализа. Значительных различий между числом идентифицированных пептидов в диапазоне концентраций 10"6-10"9 М среди анализируемых белков в растворе аналита не наблюдалось.

Зависимости числа идентифицированных пептидов молекул аналита от концентрации белка в инкубационном растворе. (А) - анализ смеси пептидов модельных белков HSA, ВМЗ на масс-спектрометрах с МАЛДИ-типом ионизации Bruker Microflex (Bruker Daltonics, Германия) и Autoflex III (Bruker Daltonics, Германия); (Б) - анализ смеси пептидов модельных белков HSA, ВМЗ на масс-спектрометре с ЭСИ-типом ионизации LC/MSD Trap ХСТ Ultra (Agilent, США).

Полученные результаты позволили заключить, что АСМ-МС (МАЛДИ и ЭСИ) позволяет выявлять и идентифицировать ковалентно выловленные из раствора аналита на поверхности АСМ-чипа белковые молекулы, различные по своим физико-химическим свойствам.

В то же время, в контрольной зоне АСМ-чипа (неактивированной) после его инкубации в растворе аналита, методом АСМ не было зарегистрировано наличия на поверхности чипа объектов, соответствующих по высоте белковым молекулам. МС-анализ также не выявил объектов белковой природы. Таким образом, экспериментально было доказано, что АСМ адекватно регистрирует искомые объекты - белковые молекулы аналита.

Следующим этапом данной работы стала отработка схемы комбинации АСМ-МС для идентификации белков, выловленных из раствора за. счет биоспефических взаимодействий.

Схема проведения, масс-спектрометрического анализа- в случае биоспецифического АСМ-фишинга белков из раствора представлена на рисунке 7. Согласно приведенной схеме сначала проводилась иммобилизация молекул-зондов на поверхность рабочей, области АСМ-чипов, в качестве которых выступала моноклональные1 антитела против белковых маркеров вирусных гепатитов В и С или аптамеры против белков гликопротеина ВИЧ-1 gpl20 и тромбина, при этом поверхность контрольной зоны» не содержала иммобилизованных молекул-зондов. Контроль качества иммобилизации молекул-зондов проводили путем AGM-визуализации. Затем такой чип инкубировали в растворе аналита, содержащий исследуемый белок. После стадии отмывки от неспецифически сорбированных молекул на поверхности чипа, и этапа подготовки образца для последующего масс спектрометрического анализа на поверхности АСМ-чипа проводили МС-анализ АСМ-зарегистрированных белков.

Экспериментальная часть данного раздела подразумевала проведение двух этапов анализа. На первом этапе необходимо было провести МС-идентификацию ковалентно иммобилизованных на АСМ-чипе белковых молекул-зондов, на втором этапе - белков-мишеней, выловленных на соответствующие молекулы-партнеры из раствора или из образцов сыворотки крови за счет биоспецифических взаимодействий. Для этого был проведен МС-анализ ковалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипов МКА против маркерных белков ВГС и ВГВ: анти-HCVcore и анти-HBVcore. Для МКА против белков анти-HCVcore и анти-HBVcore в настоящей работе впервые были получены тандемные спектры фрагментации и спектры пептидных карт.

ГОСТ Р 53761-2009

Группа Н19

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОЛОКО

Идентификация белкового состава электрофоретическим методом в полиакриламидном геле

Milk. Identification of protein composition by use of electrophoresis in polyacrilamide gel

ОКС 67.100.10
ОКСТУ 9209

Дата введения 2011-01-01

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании" , а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Государственным учреждением Ярославской области "Ярославский государственный институт качества сырья и пищевых продуктов" (ГУ ЯО "ЯГИКСПП")

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 470 "Молоко и продукты переработки молока"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 15 декабря 2009 г. N 1271-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на сырое молоко и устанавливает метод идентификации в его составе белков молочного и немолочного происхождения с использованием электрофореза в полиакриламидном геле.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р 52054-2003 Молоко коровье сырое. Технические условия

ГОСТ Р 52349-2005 Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения

ГОСТ Р 52738-2007 Молоко и продукты переработки молока. Термины и определения

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 450-77 Кальций хлористый технический. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3769-78 Реактивы. Аммоний сернокислый. Технические условия

ГОСТ 5860-75 Реактивы. Кислота аминоуксусная. Технические условия

ГОСТ 5867-96 Молоко и молочные продукты. Методы определения жира

ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия

ГОСТ 6691-77 Реактивы. Карбамид. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 7730-89 Пленка целлюлозная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13928-84 Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 20478-75 Реактивы. Аммоний надсернокислый. Технические условия

ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия

ГОСТ 24104-2001 * Весы лабораторные. Общие технические требования
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008 , здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 27752-88 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия.

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины, установленные нормативными правовыми актами Российской Федерации , ГОСТ Р 52349 , ГОСТ Р 52738 .

4 Сущность метода

Электрофорез - метод разделения веществ, основанный на явлении миграции заряженных молекул под действием внешнего электрического поля.

Находящиеся в буферном растворе (ПААГ геле) макромолекулы белков обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. При пропускании электрического тока вдоль геля, устанавливается определенный градиент напряжения, т.е. формируется электрическое поле. Под действием этого поля макромолекулы белков в соответствии со своим зарядом мигрируют в направлении катода или анода. Исследуемая проба, состоящая из различных молекул, разделяется на зоны молекул с одинаковой молекулярной массой и зарядом, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине геля в виде полос и закрепляются.

5 Средства измерения, вспомогательное оборудование, материалы, посуда и реактивы

Ячейка для вертикального электрофореза со следующими параметрами:

- общие размеры ячейки 260х190х300 мм;

- центральный термостатируемый резервуар и адаптер для трубок, изготовленные из формованного полимера;

- нижняя электродная камера и крышка, изготовленные из формованного поликарбоната;

- зажимы, подставка для заливки и эксцентрики, изготовленные из остеклованного и армированного тефлоном поликарбоната;

- электроды, изготовленные из платиновой проволоки диаметром 0,254 мм;

- пластины стеклянные размером: внутренний - 200х200 мм и внешний - 200х225 мм;

- предельное значение напряжения 1000 В.

Источник напряжения с диапазоном регулируемого напряжения (20-5000) В, силой тока (0,01-500) мА и мощностью (0,1-400) Вт.

Компьютер с характеристиками не ниже: /Celeron 600/250 mb/HDD 4Gb/CD-ROM/ видеокарта 4 Mb.

Монитор цветной с минимальными требованиями: разрешение экрана 1024x768, качество цветопередачи 16-бит.

Фотоаппарат цифровой с минимальными требованиями: разрешающая способность 1024x768, матрица - 1,3 млн. пикселей.

Анализатор потенциометрический с диапазоном измерения (0-12) ед. рН, с ценой деления 0,1 ед. рН.

Весы лабораторные 1-го класса точности (специальные) по ГОСТ 24104 с пределами абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,0003 г.

Термометр лабораторный шкальный от 0 °С до 100 °С с ценой деления 1 °С по ГОСТ 28498 .

Аппарат для встряхивания типа "Вортекс" (скорость вращения 250-3000 об/мин).

Термостат твердотельный типа "Гном" под пробирки типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см с диапазоном рабочих температур от окружающей до 99 °С.

Холодильник бытовой электрический любого типа, обеспечивающий поддержание температуры в холодильной камере (4±2) °С по ГОСТ 16317 .

Плитка электрическая бытовая с регулируемым обогревом любого типа по ГОСТ 14919 .

Электросепаратор бытовой, обеспечивающий получение обезжиренного молока с массовой долей жира не более 0,05%.

Часы 2-го класса точности по ГОСТ 27752 .

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 .

Центрифуга лабораторная с частотой вращения не менее 5000 об/мин.

Микроцентрифуга настольная типа "Эппендорф" (частота вращения не менее 13000 об/мин).

Мешалка магнитная с регулируемым электрообогревом любого типа.

Баня водяная, обеспечивающая нагрев до температуры 50 °С.

Пипетдозаторы одноканальные переменного объема:

- рабочий объем 0,002-0,02 см, шаг переменного объема 0,001 см;

- рабочий объем 0,02-0,2 см, шаг переменного объема 0,01 см;

- рабочий объем 0,2-1 см, шаг переменного объема 0,1 см.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026 .

Пленка целлюлозная по ГОСТ 7730 .

Воронка В-75-80 ХС по ГОСТ 25336 .

Колбы исполнения 2-50-2, 2-100-2, 2-500-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770 .

Колбы исполнения 1-100, Кн-1-50-14/23 ХС, Кн-1-100-29/32 ХС, Кн-1-250-24/29 ХС, Кн-1-500-29/32 ХС, Кн-1-2000-29/32 ХС по ГОСТ 25336 .

Цилиндры исполнения 1-50-2, 1-100-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770 .

Эксикатор по ГОСТ 23932 .

Пипетка исполнения 1-1-2-10, 1-1-2-25 по ГОСТ 29227 .

Насос водоструйный по ГОСТ 25336 .

Микрошприц вместимостью 0,05 см.

Пробирки микроцентрифужные типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см.

Стакан исполнения В-1-50 ХС, В-1-100 ХС, В-1-250 ХС по ГОСТ 25336 .

Наконечники для дозаторов с переменным объемом 0,02, 0,2 и 1 см.

Акриламид (массовая доля основного вещества не менее 99,9%).

N",N"-Метиленбисакриламид, для электрофореза.

Трис-(гидроксиметил)-аминометан (массовая доля основного вещества не менее 99,8%).

Карбамид, ч.д.а., по ГОСТ 6691 .

Кумасси бриллиантовый голубой G-250, для электрофореза.

Кислота аминоуксусная, х.ч., по ГОСТ 5860 .

Бромфеноловый синий, для электрофореза.

Аммоний надсернокислый, х.ч., по ГОСТ 20478 .

N,N,N",N"-Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), для электрофореза.

Ацетон, х.ч., по ГОСТ 2603 .

Глицерин, ч.д.а., по ГОСТ 6259 .

Эфир диэтиловый, ч.д.а., по .

Кислота соляная, х.ч., по ГОСТ 3118 .

Аммоний сернокислый, х.ч., по ГОСТ 3769 .

Спирт этиловый по ГОСТ Р 51652 .

Кислота уксусная ледяная, х.ч., по ГОСТ 61 .

Кальций хлористый безводный по ГОСТ 450 .

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 .

Допускается применять другие средства измерений, вспомогательные устройства и реактивы с метрологическими или техническими характеристиками не хуже указанных.

6 Отбор проб для анализа

Основные понятия и общие правила отбора проб - по ГОСТ 13928 и ГОСТ 26809 .

Пробы транспортируют при температуре от 2 °С до 8 °С не более 12 ч.

В случае, если анализ не может быть проведен сразу, пробы рекомендуется хранить в холодильнике при температуре (4±2) °С не более 24 ч.

Не допускается консервирование проб.

7 Подготовка к проведению анализа

7.1 Приготовление растворов

7.1.1 Раствор соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм

В мерную колбу вместимостью 1000 см вносят около 500 см дистиллированной воды и 90 см концентрированной соляной кислоты плотностью 1,174 г/см (или 85 см концентрированной соляной кислоты плотностью 1,188 г/см), аккуратно перемешивают и доводят полученный объем дистиллированной водой до метки.

Срок хранения раствора - 3 мес.

7.1.2 Раствор карбамида молярной концентрацией 6 моль/дм

В химическом стакане вместимостью 50 см растворяют (18,02±0,01) г карбамида в 30 см дистиллированной воды, переливают в мерную колбу вместимостью 50 см и доводят полученный объем дистиллированной водой до метки.

7.1.3 Раствор лидирующего красителя

В микроцентрифужную пробирку типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см помещают (0,0040±0,0003) г бромфенолового синего, добавляют 1 см дистиллированной воды и перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс" (до полного растворения красителя).

Срок хранения раствора при температуре (4±2) °С - 1 мес.

7.1.4 Раствор трис-НСl

В химическом стакане вместимостью 100 см растворяют (6,070±0,001) г трис-(гидрооксиметил) аминометана в 50 см дистиллированной воды, доводят раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм до (8,8±0,1) ед. рН, переливают в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят до метки.

7.1.5 Раствор мономеров полиакриламидного геля

В коническую колбу вместимостью 50 см вносят (3,1040±0,0003) г акриламида, (0,0960±0,0003) г N",N"-метиленбисакриламида, (3,1040±0,0003) г карбамида, добавляют 8,75 см раствора трис-НСl, приготовленного по 7.1.4 и 26 см дистиллированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке с электроподогревом при температуре (50±5) °С в течение 30 мин и охлаждают до комнатной температуры.

Срок хранения раствора в стеклянной колбе с притертой пробкой при температуре (4±2) °С - 1 мес.

Примечание - Количество раствора для полиакриламидного геля дано для одного анализа и получения геля размером (160х160х1) мм.

7.1.6 Раствор электродного буфера

В мерную колбу вместимостью 500 см вносят (4,50±0,01) г трис-(гидрооксиметил) аминометана, (21,60±0,01) г аминоуксусной кислоты и растворяют в 300 см дистиллированной воды, полученный объем доводят до метки, переливают в коническую колбу вместимостью 2000 см и добавляют 1000 см дистиллированной воды.

Срок хранения раствора в стеклянной колбе с притертой пробкой при температуре (4±2) °С - 1 мес.

Примечание - Количество электродного буфера одного анализа дано для одной электрофоретической ячейки с параметрами, указанными в разделе 5. При использовании электрофоретической ячейки другого типа количество электродного буфера должно быть соответственно скорректировано.

7.1.7 Раствор для окрашивания геля

В коническую колбу вместимостью 500 см вносят (0,50±0,01) г кумасси бриллиантового голубого, добавляют 200 см этилового спирта, 50 см кислоты уксусной ледяной и 250 см дистиллированной воды. Содержимое колбы тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора в стеклянной колбе с притертой пробкой при температуре (4±2) °С - 1 мес.

7.2 Подготовка контрольных проб

Для приготовления контрольных проб используют сырое молоко по ГОСТ Р 52054 и с кислотностью (16,0-20,0) °Т без содержания консервантов и ингибирующих веществ.

7.2.1 Отделение жира

7.2.1.1 Метод сепарирования

(0,4-0,5) дм молока перед сепарированием подогревают на водяной бане до температуры (40-45) °С.

Через 1-2 мин после включения электропривода сепаратора для прогрева молочного тракта через электросепаратор пропускают 1 дм дистиллированной воды, нагретой до температуры (40-50) °С. Далее, не выключая электропривод сепаратора, заливают предварительно подогретое молоко и сепарируют. После сепарирования обезжиренное молоко используют для дальнейшего анализа.

7.2.1.2 Метод центрифугирования

(0,4-0,5) дм молока помещают в центрифужные пробирки или стаканы и центрифугируют при 5000 об/мин в течение (20-30) мин. После центрифугирования центрифужные пробирки (стаканы) помещают в холодильник и охлаждают при температуре (4±2) °С. После полного охлаждения застывший верхний жировой слой удаляют, а оставшееся обезжиренное молоко используют для дальнейшего анализа.

7.2.2 Выделение белков

В химический стакан вместимостью 250 см вносят 50 см предварительно обезжиренного молока (с массовой долей жира не более 0,05% по ГОСТ 5867-90), нагревают на водяной бане до температуры (35-40) °С и осаждают казеин, прибавляя по каплям раствор соляной кислоты, приготовленный по 7.1.1. Осадку дают отстояться, сыворотку осторожно сливают. Осадок промывают, добавляя 50 см дистиллированной воды, перемешивают, дают отстояться и сливают воду. Промывку проводят не менее пяти раз.

К отмытому осадку добавляют 30 см ацетона и оставляют на 30 мин, затем ацетон осторожно сливают. Действие повторяют до полного удаления жира, но не менее пяти раз. Осадок фильтруют через сухой складчатый фильтр и переносят в коническую колбу вместимостью 250 см, заливают 120 см диэтилового эфира и закрывают притертой пробкой. Перемешивают не менее 5 мин и оставляют на 12 ч в холодильнике. Через 12 ч осадок фильтруют через сухой складчатый фильтр и подсушивают на воздухе в вытяжном шкафу не менее 1 часа.

(10,0±0,1) г подсушенной пробы переносят в коническую колбу вместимостью 100 см, добавляют 60 см раствора карбамида, приготовленного по 7.1.2, перемешивают на магнитной мешалке при температуре (50±5) °С до полного растворения белка. Получившийся раствор переносят в мешочек для диализа, изготовленный из целлофановой пленки, который погружают в дистиллированную воду и помещают в холодильник. Диализ (освобождение раствора от низкомолекулярных соединений) проводят не менее 24 ч при периодической смене дистиллированной воды. После чего образовавшийся осадок фильтруют через сухой складчатый фильтр и высушивают в эксикаторе над безводным хлористым кальцием не менее 4 часов.

Срок хранения выделенного казеина при температуре (4±2) °С - не более 2-х недель.

Сыворотку, оставшуюся после выделения казеина, сливают в коническую колбу вместимостью 250 см и добавляют аммоний сернокислый (на 25 см сыворотки (17,5±0,1) г аммония сернокислого), и тщательно перемешивают до полного растворения. Помещают в холодильник при температуре (4±2) °С на 12 ч. Отделившийся белок фильтруют через сухой складчатый фильтр и переносят в мешочек для диализа, изготовленный из целлофановой пленки, который погружают в дистиллированную воду и помещают в холодильник. Диализ проводят не менее 24 ч при периодической смене дистиллированной воды. Через 24 ч образовавшийся осадок фильтруют через сухой складчатый фильтр и высушивают в эксикаторе над безводным хлористым кальцием не менее 4 ч.

Срок хранения сывороточных белков при температуре (4±2) °С - не более 2-х недель.

7.3 Подготовка исследуемых проб молока

Отделение жира и выделение белков исследуемых проб молока осуществляется по 7.2.1 и 7.2.2.

7.4 Приготовление растворов белков

7.4.1 Приготовление контрольных растворов белков

В микроцентрифужную пробирку типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см помещают (0,0040±0,0003) г белка, выделенного по 7.2, 7.3, добавляют 0,5 см раствора карбамида, приготовленного по 7.1.2, выдерживают в термостате при температуре 95 °С в течение 5 мин, тщательно перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс" до полного растворения белков. К полученному раствору добавляют 0,2 см глицерина и 0,025 см лидирующего красителя, приготовленного по 7.1.3, тщательно перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс", центрифугируют при частоте 3000 об/мин в течение 5 мин, образовавшийся осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость используют для анализа.

Срок хранения растворов белков при температуре (4±2) °С - не более семи суток.

7.4.2 Приготовление исследуемых растворов белков

Приготовление исследуемых растворов белков осуществляется по 7.4.1.

8 Условия проведения анализа

При выполнении анализа должны соблюдаться следующие условия:


	Температура окружающего воздуха
	Относительная влажность воздуха	от 30% до 80%
	Атмосферное давление	от 84 до 106 кПа
	Напряжение в сети
	Частота переменного тока

9 Проведение анализа

При сборке камеры для полимеризации геля используют стеклянные пластины размером: внутренняя - (200х200) мм и внешняя - (200х225) мм.

На внешнюю пластину справа и слева вдоль длинных сторон помещают спейсеры (пластинки) толщиной 1 мм. Поверх спейсеров накладывают внутреннюю стеклянную пластину. Пластины фиксируют зажимами справа и слева и устанавливают на подставку для заливки с желобом для выравнивания. Камеру проверяют на герметичность с помощью дистиллированной воды, которую затем удаляют. После проверки камеры на герметичность между пластинами камеры под небольшим углом помещают гребенку для формирования лунок.

Для обеспечения нормального процесса полимеризации геля раствор мономеров, приготовленный по 7.1.5, подвергают деаэрации в колбе с тубусом, присоединенной к водоструйному насосу. После деаэрации в раствор добавляют (0,0180±0,0003) г аммония надсернокислого и 0,018 см N,N,N",N"-тетраметилэтилендиамина, осторожно перемешивают для предотвращения образования пузырей в растворе. Стеклянной пипеткой с грушей вдоль края спейсера (с приподнятой стороны гребенки) раствор вносят в камеру для полимеризации.

Гель полимеризуется в течение 45 мин, после чего гребенку извлекают и ополаскивают образовавшиеся в геле лунки дистиллированной водой.

Камеру с гелем прикрепляют к термостатируемой части и помещают в электрофоретическую ячейку.

В электродные камеры ячейки заливают электродный буфер, приготовленный по 7.1.6.

В лунки геля под электродный буфер с помощью микрошприца вносят контрольные и исследуемые растворы белков, приготовленные по 7.4. Крайние лунки геля рекомендуется использовать для контрольных растворов белков. Количество раствора, вносимого в одну лунку, составляет (0,020-0,025) см. После каждого внесения микрошприц тщательно промывают раствором электродного буфера.

Для получения достоверных результатов рекомендуется каждый исследуемый раствор белка вносить не менее чем в трех повторностях.

После внесения контрольных и исследуемых растворов электрофоретическую ячейку закрывают крышкой.

Электрофорез проводят в течении (4-5) ч в режиме постоянного напряжения (120-130) В.

Примечание - Режим указан для электрофоретической ячейки с параметрами, указанными в 5, и полиакриламидного геля размером (160х160х1) мм. При использовании ячейки другого типа или геля с другими размерами режим проведения электрофореза подбирается индивидуально.

Для предотвращения неравномерного распределения тепла и искажения белковых зон (полос) рекомендуется обеспечить принудительное охлаждение термостатируемого резервуара.

Электрофорез считают законченным, когда лидирующий краситель опустится до нижнего края геля.

После проведения электрофореза гель аккуратно извлекают из электрофоретической ячейки, фиксируют и окрашивают. Фиксация и окраска осуществляются одновременно в растворе, приготовленном в соответствии с 7.1.7, в течение 2 ч. Для ускорения процесса допускается проводить окрашивание и фиксацию геля в течение одного часа на электроплитке при (40±5) °С, а ванночку с раствором и гелем необходимо регулярно покачивать.

Отмывку окрашенного геля производят кипячением в 10%-ном растворе уксусной кислоты до полного удаления фона с постоянной сменой отмывающего раствора по мере вымывания краски.

В приложении А приведены возможные причины отклонения от стандартного хода анализа и предложены способы их устранения.

Визуализацию разделения белков после электрофореза осуществляют с помощью фотоаппарата. Полученные электрофореграммы сохраняют на жестком магнитном носителе компьютера.

10 Интерпретация результатов анализа

Идентификацию белков молочного и немолочного происхождения осуществляют визуально.

Совпадение белковых фракций (полос) на электрофореграмме контрольного и исследуемых растворов (не менее чем в трех повторностях) указывает на отсутствие в составе продукта белков немолочного происхождения (рисунок 1).

Рисунок 1 - Электрофореграмма раствора белков исследуемой пробы, в составе которой отсутствуют белки немолочного происхождения

При наличии в исследуемой пробе белков немолочного происхождения на электрофореграмме присутствуют дополнительные белковые фракции (полосы), которые не наблюдаются в контрольных пробах (рисунок 2).

Рисунок 2 - Электрофореграмма раствора белков исследуемой пробы, в составе которой присутствует белок немолочного происхождения

В случае возникновения сомнений о наличии в исследуемой пробе белков немолочного происхождения (слабое изображение отдельных фракций) рекомендуется увеличить концентрацию белков в пробе и повторить анализ.

11 Требования, обеспечивающие безопасность

При проведении электрофоретического анализа необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007 , требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации и инструкции по эксплуатации ячейки для электрофореза.

Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009 . Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать допустимых значений по ГОСТ 12.1.005 .

При работе с нейротоксинами следует соблюдать особую осторожность, все манипуляции обязательно проводить в резиновых перчатках и только в вытяжном шкафу.

К выполнению анализа и обработке результатов допускают специалиста, имеющего высшее или среднее специальное биохимическое образование, или опыт работы в биохимической лаборатории, прошедшего соответствующий инструктаж и освоившего метод в процессе обучения.

Приложение А (справочное). Причины отклонения от стандартного хода анализа и способы их устранения

Приложение А
(справочное)

Таблица А.1


Отклонение	Возможные причины	Способы устранения
1 Полосы по краям геля расположены выше, чем в центре	Центральная часть геля нагревается сильнее краев	Центральный резервуар заполнить охлаждающим раствором
	Избыточное напряжение	Охлаждающий раствор прокачивать при температуре (10-15) °С; уменьшить напряжение
2 Диффузия лидирующего красителя	Распад раствора белков пробы и/или растворов буферов	Приготовить растворы из свежих реактивов
	Диффузия	Если полосы белка имеют такой же диффузный характер, как и полоса лидирующего красителя, увеличить: силу тока на (25-50)%
3 Вертикальная исчерченность трека	Избыточная концентрация белков в пробе	Уменьшить концентрацию белков в пробе; уменьшить напряжение на 25%
4 Горизонтальная исчерченность трека	Неполное растворение белков	Полностью растворить пробу; центрифугировать
5 Широкие или размытые полосы или пятна белков	Диффузия в связи с медленной миграцией	Увеличить силу тока на 20%
	Химические модификации ионными загрязнениями	Деионизовать раствор карбомида
	Неполное обезжиривание пробы	Полностью удалить жир
6 Размывание полос в латеральном направлении	Диффузия растворов белков за пределы лунок до включения напряжения	Уменьшить время между внесением пробы и подачей напряжения
7 Искривленные полосы	Недостаточная полимеризация геля вокруг лунок	Дегазировать раствор мономеров геля; увеличить концентрации аммония надсернокислого и N,N,N",N"-тетраметилэтилендиамина на 25%
	Наличие солей в пробе	Удалить соли диализом
	Неровная поверхность геля	Проверить стадию взятия проб для приготовления геля, при необходимости заменить реактивы
8 Электрофорез занимает более 5 ч	Высокая концентрация электродного буфера	Проверить стадию приготовления электродного буфера (при необходимости разбавить буфер), проверить качество дистиллированной воды, заменить реактивы
	Низкое напряжение	Увеличить напряжение на (25-50)%
9 Электрофорез идет слишком быстро с плохим разрешением	Буфер слишком разбавлен	Проверить стадию приготовления электродного буфера, проверить качество дистиллированной воды, заменить реактивы
	Слишком высокое напряжение	Уменьшить напряжение на (25-50)%
10 Наблюдается несовпадение полос в контрольных пробах	Часть белка могла окислиться во время электрофореза или не была полностью восстановлена на стадии подготовки пробы	Приготовить свежие контрольные пробы; заменить реактивы

Библиография

Федеральный закон Российской Федерации от 12 июня 2008 г. N 88-ФЗ "Технический регламент на молоко и молочную продукцию"

ТУ 2600-001-43852015-05 Эфир диэтиловый

Электронный текст документа

подготовлен АО "Кодекс" и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2010

высаливание : осаждение солями щелочных, щелочноземельных металлов (хлорид натрия, сульфат магния), сульфатом аммония; при этом не нарушается первичная структура белка;

осаждение : использование водоотнимающих веществ: спирт или ацетон при низких температурах (около –20 С).

При использовании этих методов белки лишаются гидратной оболочки и выпадают в осадок в растворе.

Денатурация - нарушение пространственной структуры белков (первичная структура молекулы сохраняется). Может быть обратимая (структура белка восстанавливается после устранения денатурирующего агента) или необратимая (пространственная структура молекулы не восстанавливается, например, при осаждении белков минеральными концентрированными кислотами, солями тяжелых металлов).

Методы разделения белков Отделение белков от низкомолекулярных примесей

Диализ

Используют специальную полимерную мембрану, которая имеет поры определенной величины. Малые молекулы (низкомолекулярные примеси) проходят через поры в мембране, а крупные (белки) задерживаются. Таким образом, белки отмывают от примесей.

Разделение белков по молекулярной массе

Гель-хроматография

Хроматографическую колонку заполняют гранулами геля (сефадекс), который имеет поры определенной величины. В колонку вносят смесь белков. Белки, размер которых меньше, чем размер пор сефадекса, задерживаются в колонке, так как «застревают» в порах, а остальные свободно выходят из колонки (рис. 2.1). Размер белка зависит от его молекулярной массы.

Рис. 2.1. Разделение белков методом гель-фильтрации

Ультрацентрифугирование

Этот метод основан на различной скорости седиментации (осаждения) белковых молекул в растворах с различным градиентом плотности (сахарозный буфер или хлорид цезия) (рис. 2.2).

Рис. 2.2. Разделение белков методом ультрацентрифугирования

Электрофорез

Данный метод основан на различной скорости миграции белков и пептидов в электрическом поле в зависимости от заряда.

Носителями для электрофореза могут служить гели, ацетатцеллюлоза, агар. Разделяемые молекулы движутся в геле в зависимости от размера: те из них, которые имеют бóльшие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, бóльшие молекулы будут находиться ближе к старту, чем меньшие (рис. 2.3).

Рис. 2.3 . Разделение белков методом электрофореза в геле

Методом электрофореза можно разделить белки и по молекулярной массе. Для этого используют электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДS-Na) .

Выделение индивидуальных белков

Аффинная хроматография

Метод основан на способности белков прочно связываться с различными молекулами нековалентными связями. Используется для выделения и очистки ферментов, иммуноглобулинов, рецепторных белков.

Молекулы веществ (лиганды), с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного вещества. Смесь белков вносят в колонку, и искомый белок прочно присоединяется к лиганду. Остальные белки свободно выходят из колонки. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии лиганд. Этот высокочувствительный метод позволяет выделить в чистом виде очень малые количества белка из клеточного экстракта, содержащего сотни других белков.

Изоэлектрофокусирование

Метод основан на различной величине ИЭТ белков. Белки разделяют методом электрофореза на пластине с амфолином (это вещество, у которого заранее сформирован градиент pH в диапазоне от 3 до 10). При электрофорезе белки разделяются в соответствии со значением их ИЭТ (в ИЭТ заряд белка будет равен нулю, и он не будет передвигаться в электрическом поле).

Двухмерный электрофорез

Представляет собой сочетание изоэлектрофокусирования и электрофореза с ДДС-Na. Проводят сначала электрофорез в горизонтальном направлении на пластине с амфолином. Белки разделяются в зависимости от заряда (ИЭТ). Затем обрабатывают пластину раствором ДДС-Na и проводят электрофорез в вертикальном направлении. Белки разделяются в зависимости от молекулярной массы.

Иммуноэлектрофорез (Вестерн-блот)

Аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце (рис 2.4).

Выделение белков из биологического материала.

Разделение белков по молекулярной массе методом электрофореза в ПААГ с ДДС-Na.

Перенос белков с геля на полимерную пластину с целью облегчения дальнейших работ.

Обработка пластины раствором неспецифического белка для заполнения оставшихся пор.

Таким образом, после этого этапа получена пластинка, в порах которой содержатся разделенные белки, а пространство между ними заполнено неспецифическим белком. Теперь надо выявить, есть ли среди белков искомый, ответственный за какое-то заболевание. Для выявления используют обработку антителами. Под первичными антителами понимают антитела к искомому белку. Под вторичными антителами понимают антитела к первичным антителам. В состав вторичных антител вводят дополнительно специальную метку (т.н. молекулярный зонд), чтобы потом можно было визуализировать результаты. В качестве метки используются радиоактивный фосфат или фермент, прочно связанные с вторичным антителом. Связывание сначала с первичными, а затем с вторичными антителами преследует две цели: стандартизация метода и улучшение результатов.

Обработка раствором первичных антител  связывание происходит в том месте пластины, где есть антиген (искомый белок).

Удаление несвязавшихся антител (промывка).

Обработка раствором меченых вторичных антител для последующей проявки.

Удаление несвязавшихся вторичных антител (промывка).

Рис. 2.4 . Иммуноэлектрофорез (Вестерн-блот)

В случае присутствия искомого белка в биологическом материале – на пластинке появляется полоса, свидетельствующая о связывании этого белка с соответствующими антителами.

Рекомендованный список диссертаций

Посттрансляционная регуляция цитохромов Р450 подсемейства 2В 2013 год, доктор биологических наук Згода, Виктор Гаврилович

Масс-спектрометрическое определение активности и содержания цитохромов P450 2013 год, кандидат биологических наук Москалева, Наталья Евгеньевна

Структурно-функциональное картирование белков цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем 2002 год, доктор биологических наук Колесанова, Екатерина Федоровна

Похожие диссертационные работы по специальности «Математическая биология, биоинформатика», 03.01.09 шифр ВАК

Транскриптомно-протеомный подход для анализа протеоформ клеточной линии HepG2 2018 год, кандидат биологических наук Киселева, Ольга Игоревна

Поиск и идентификация потенциальных биомаркеров рака яичников в сыворотке крови человека 2015 год, кандидат биологических наук Арапиди, Георгий Павлович