Процессы репликации и транскрипции. Как происходит репликация днк Молекулярные механизмы репликации днк

Репликация ДНК - это процесс удвоения родительских молекул ДНК во время воспроизводства клеток живых организмов. То есть процесс репликации предшествует делению клеток. Репликация, как и транскрипция и трансляция, является матричным процессом . При репликации цепи молекулы ДНК расходятся и каждая из них становится матрицей, на которой синтезируется новая комплементарная цепь. При этом нуклеотиды новых цепей спариваются комплементарно с нуклеотидами старых цепей (А с Т, Г с Ц). В результате образуются две дочерние двуспиральные молекулы ДНК, не отличимые от родительской молекулы. Каждая молекула ДНК состоит из одной цепи исходной родительской молекулы и одной вновь синтезированной цепи. Такой механизм копирования называется полуконсервативным . Каждая вновь синтезированная цепь антипараллельна родительской. Синтез одной цепи (лидирующей) происходит непрерывно, а др. (отстающей) – импульсно. Такой механизм называется полунепрерывным.

Строение репликативной вилки. Лидирующая нить, отстающая нить, фрагменты Оказаки. см. рисунок.

Ключевые ферменты, участвующие в синтезе ДНК.

Общие структурные черты ДНК-полимераз.

Работают по одному принципу: удлиняют цепь ДНК, добавляя к 3’-концу по 1 нуклеотиду. Выбор диктуется требованиям комплиментарности матричной ДНК. Черты:

Несколько независимых доменов, кот. в совокупности напоминают правую руку человека. ДНК связывается в небольшой выемке, образованной тремя доменами. Основу каталитического центра образуют консервативные аминокислотные мотивы в составе домена «ладонь». «Пальцы» правильным образом располагают матрицу в активном центре. «Большой палец» связывает ДНК на выходе из фермента и обуславливает высокую процессивность. В активном центре самые важные консервативные области всех трех доменов сближены и образуют непрерывную поверхность. Экзонуклеазная активность находится в независимом домене с собственным каталитическим центром. N-концевой домен внедрен в экзонуклеазный.

Особенности днк-полимеразы I.

Участвует в репарации поврежденной ДНК, также играет вспомогательную роль в репликации ДНК – удлиняет 3’-конец цепи, спаренной с матричной цепью и позволяет заполнить пробелы м/д фрагментами отстающих цепей, удлиняет фрагменты Оказаки с 3’-концов, одновременно удаляя рибонуклеозиды РНК-затравки, с кот. начинается каждый фрагмент Оказаки. ДНК-полимераза I способна удлинять 3’-конец одной цепей в месте разрыва в двуцепочечной ДНК и удалять нуклеотиды с 5’-конца того же разрыва (ник-трансляция) – важная роль в системе репарации.

ДНК-полимера» I доминирует нал всеми другими. Это оценочный полипептид массой 103 кДа, который может быть расщеплен на 2 части: С-концевой фрагмент, 68 кДа, фрагмент Кленова, облагает полимеразной и 3’->5" экзонуклеазными активностями; N-коицевой фрагмент, 35 кДа, обладает 5’->3" экзонуклеазной актнвностью.

Холофермент, днк-полимераза III, реплисома.

Холофермент представляет собой комплекс массо1 900кДа, содержащий 10 белков, подразделенных на 4 типа субкомплексов:

α, ξ, θ. Содержит 2 копии каталитической сердцевины. α – ДНК-полимеразная активность, ξ – 3’-экзонуклеазная активность, θ – стимулирует экзонуклеазу.

Содержит 2 субъединицы τ (тау) – служат для скрепления минимального фермента, обладающего каталитической активностью (α).

2 копии зажима (clamp) – отвечают за удержание минимального фермента на ДНК-матрицах. Каждый состоит из гомодимера субъединиц β. Главная роль – свести к минимуму вероятность отделения фермента от матрицы, прежде чем завершится процесс копирования.

γ – группа из 5 белков, кот. образуют клэмп-лоудер – приспособление для накладывания зажима на ДНК матрицу. Состоит из 2 δ, 1 γ, 1 ψ и 1 χ – субъединиц.

Реплисома - мультиферментный комплекс в бактериальной репликативной вилке, осуществляющий процесс полуконсервативной репликации; содержит ДНК-полимеразу и ряд др. белков.

ДНК-полимеразы эукариот.

ДНК-полимераза α – инициирует синтез новой цепи и отстающей. Ассоциирована с β-субъединицей и двумя небольшими белками с праймазной активностью, поэтому может синтезировать цепи заново. 2 функции: затравка и удлинение = α-праймаза.

ДНК-полимераза δ – элонгирует ведущую цепь

ДНК-полимераза ξ – участвует в синтезе отстающей цепи

ДНК-лигазы.

Необходимы для соединения цепей ДНК при репликации, репарации, рекомбинаци. ДНК-лигазы E.coli и фага Т4 – одиночные пептиды, способные соединять концы двух разных дуплексных фрагментов или разорванные концы цепей линейной или кольцевой ДНК. Т.о., с помощью ДНК-лигаз могут образовываться и линейные и кольцевые дуплексные молекулы ДНК.

ДНК-хеликазы.

Осуществляет расплетание цепей, используя энергию гидролиза АТФ. Функционирует в составе комплекса, осуществляющего перемещение репликативной вилки и репликацию расплетенных цепей. Для увеличения скорости несколько зеликаз могут действовать совместно.

SSB -белки.

Однонитевые связывающие белки, дестабилизируют спираль, связываются с одноцепочечным участком, тем самым ее стабилизируют, т.е. фиксируют участок одноцепочечной ДНК.

ДНК-топоизомеразы I и II , гираза.

При расплетении ДНК происходит вращение молекулы - изменение вторичной и третичной структур. Эти процессы катализирует группа ферментов, называемых топоизомеразами. Они вносят одно и двуцепочечные разрывы в ДНК, что позволяет молекуле нуклеиновой кислоты вращаться и становиться матрицей. По механизму действия различают топоизомеразы первого (I) и второго (II) типов.

Топоизомеразы типа I (у Е. coli - свивелаза) - вносят одноцепочечный разрыв в молекулу ДНК, топоизомеразы типа II (у Е. coli - гираза) - осуществляют двухцепочечный разрыв ДНК и перенос нитей ДНК через разрыв с последующим их сшиванием. При этом, осуществляя свои функции, топизомеразы остаются связанными с молекулой ДНК. В этих процессах топоизомеразами используется остаток тирозина, который осуществляет нуклеофильную атаку фосфатной группы ДНК с образованием фосфотирозина. В результате ферменты оказываются ковалентно связанными с 5’- или 3’- концами ДНК в месте разрыва. Образование такой ковалентной связи исключает необходимость затраты энергии при восстановлении фосфодиэфирной связи в одноцепочечном разрыве на заключительных стадиях реакции. У ДНК-топоизомераз типа I имеется один каталитический остаток тирозина на молекулу мономерного белка, тогда как димеры ДНК- топоизомераз II содержат по одному каталитическому остатку на каждую субъединицу, что обеспечивает создание ступенчатого двухцепочечного разрыва в молекуле ДНК.

Топоизомеразы выполняют функции шарниров, однако их действия противоположны. Топоизомеразы I, разрывая одну из цепей кольцевой суперспирализованной ДНК, раскручивают цепи и уменьшают число супервитков. Топоизомеразы II превращают расслабленную несверхспирализованную замкнутую кольцевую ДНК в суперспираль.

Стадии репликации: инициация, элонгация, терминация. Инициация образования новых цепей ДНК. Праймаза. Праймосома. Терминация репликации ДНК и расхождение дочерних спиралей у прокариот.

Терминация репликации в линейных геномах. Проблема репликации линейного незамкнутого фрагмента ДНК. Теломеры и теломерные повторы, теломерная петля. Теломераза. Механизм работы теломеразы. Особенности репликации ДНК эукариот. Репликоны эукариот.

Как и в случае биосинтеза других макромолекул клетки, процесс репликации условно разделяют на три основных этапа : инициацию, элонгацию и терминацию.

Репликация прокариот

Инициация

Хромосома прокариот чаще всего представлена единичной суперскрученной кольцевой молекулой с одним или двумя сайтами начала репликации. Для того чтобы каждая из двух цепей ДНК стала матрицей, для синтеза новой цепи, необходимо, чтобы нити ДНК расправились и отошли друг от друга. Установлено, что цепи ДНК раскручиваются не по всей длине, а на коротком участке. Здесь образуется вилка репликации - место удвоения ДНК.

При расплетении ДНК происходит вращение молекулы - изменение вторичной и третичной структур. Эти процессы катализирует группа ферментов, называемых топоизомеразами . Они вносят одно и двуцепочечные разрывы в ДНК, что позволяет молекуле нуклеиновой кислоты вращаться и становиться матрицей. По механизму действия различают топоизомеразы первого (I) и второго (II) типов.

На расплетенный участок родительской молекулы ДНК, с которого начинается репликация и который называется точкой начала репликации (или ориджином, oriС) «садятся» инициаторные белки. Инициация репликации в oriC начинается с формирования комплекса, в который входят шесть белков DnaA, DnaB, DnaC, HU, гираза и SSB.

Сначала с девятинуклеотидной последовательностью связываются белки DnaA , которые формируют большой агрегат. ДНК ориджина опоясывает его, и цепи ДНК разъединяются в области трех 13-членных последовательностей. На следующем этапе присоединяются белки DnaB (хеликаза) и DnaC, формируя агрегат размером 480 кДа, с радиусом 6 нм. Хеликаза/ DnaB обеспечивает разрыв водородных связей между азотистыми основаниями в двойной цепи ДНК, приводя к ее денатурации, т.е. расхождению нитей.

В результате выпрямления и денатурации двойной спирали ДНК формируется вилка репликации, имеющая Y-образную форму (рис). Именно в этой репликационной вилке ДНК-полимеразы синтезируют дочерние молекулы ДНК. Такой участок ДНК выглядит как пузырек или «глазок» в нереплицированной ДНК. Репликационные «глазки» образуются в тех местах, где находятся точки начала репликации. Когда цепи ДНК разъединены, молекула становится довольно подвижной. Все возможные нарушения в структуре одиночных цепей исключаются благодаря действию белков SSВ (single-strand DNA-binding proteins или helix-destabilizing proteins), которые, связываясь с, одиночными цепями ДНК, препятствуют их слипанию.

Нуклеиновые кислоты играют большую роль в обеспечении жизнедеятельности клеток живых организмов. Важным представителем этой группы органических соединений является ДНК, которая несет всю генетическую информацию и отвечает за проявление необходимых признаков.

Что такое репликация?

В процессе деления клеткам необходимо увеличить количество нуклеиновых кислот в ядре, чтобы не произошла потеря генетической информации в процессе. В биологии репликация - это удвоение ДНК путем синтеза новых цепей.

Основная цель этого процесса заключается в передаче генетической информации дочерним клеткам в неизменном виде без каких-либо мутаций.

Ферменты и белки репликации

Удвоение молекулы ДНК можно сравнить с любым метаболическим процессом в клетке, для которого необходимы соответствующие белки. Так как в биологии репликация - это важная составляющая клеточного деления, соответственно, немало вспомогательных пептидов здесь участвуют.

• ДНК-полимераза - важнейший фермент редупликации, который отвечает за синтез дочерней цепи В цитоплазме клетки в процессе репликации обязательно присутствие нуклеиновых трифосфатов, которые приносят все нуклеиновые основания.

Эти основания являются мономерами нуклеиновой кислоты, поэтому из них строится вся цепочка молекулы. ДНК-полимераза отвечает за процесс сборки в правильном порядке, иначе неизбежно появление всевозможных мутаций.

• Праймаза - белок, который отвечает за формирование затравки на матричной цепи ДНК. Эта затравка называется также праймер, она имеет Для фермента ДНК-полимераза важно наличие начальных мономеров, с которых возможен дальнейший синтез всей полинуклеотидной цепочки. Эту функцию выполняет праймер и соответствующий ему фермент.
• Хеликаза (геликаза) формирует репликационную вилку, которая представляет собой расхождение матричных цепей путем разрыва водородных связей. Так полимеразам проще подойти к молекуле и начать синтез.
• Топоизомераза. Если представить молекулу ДНК в виде закрученной веревки, при продвижении полимеразы по цепи будет формироваться положительное напряжение из-за сильного скручивания. Эту проблему решает топоизомераза - фермент, который на короткое время разрывает цепочку и разворачивает при этом всю молекулу. После чего поврежденное место сшивается вновь, а ДНК не испытывает напряжения.
• Ssb-белки, как грозди, присоединяются к цепям ДНК в репликационной вилке, чтобы предупредить повторное формирование водородных связей раньше окончания процесса редупликации.
• Лигаза. заключается в сшивании фрагментов Оказаки на отстающей цепи молекулы ДНК. Происходит это путем вырезания праймеров и встраивания на их месте нативных мономеров дезоксирибонуклеиновой кислоты.

В биологии репликация - это сложный многоступенчатый процесс, который предельно важен при делении клеток. Поэтому использование различных белков и ферментов необходимо для эффективного и правильного синтеза.

Механизм редупликации

Существует 3 теории, которые объясняют процесс удвоения ДНК:

1. Консервативная утверждает, что одна дочерняя молекула нуклеиновой кислоты имеет матричную природу, а вторая полностью синтезирована с нуля.
2. Полуконсервативная предложена Уотсоном и Криком и подтверждена в 1957 году в опытах на E. Coli. Эта теория гласит, что обе дочерние молекулы ДНК имеют одну старую цепочку и одну новосинтезированную.
3. Дисперсивный механизм основан на теории о том, что дочерние молекулы имеют по всей длине чередующиеся участки, состоящие как из старых, так и из новых мономеров.

Сейчас научно доказана полуконсервативная модель. Что такое репликация на молекулярном уровне? В начале хеликаза разрывает водородные связи молекулы ДНК, открывая тем самым обе цепи для фермента полимеразы. Последние после формирования затравок начинают синтез новых цепей в направлении 5’-3’.

Свойство антипараллельности ДНК является основной причиной формирования, лидирующей и отстающей цепей. На лидирующей цепи ДНК-полимераза движется беспрерывно, а на отстающей она формирует фрагменты Оказаки, которые в будущем будут соединены с помощью лигазы.

Особенности репликации

Сколько молекул ДНК в ядре после репликации? Сам процесс подразумевает удвоение генетического набора клетки, поэтому в синтетический период митоза диплоидный набор имеет в два раза больше молекул ДНК. Такая запись обычно помечается как 2n 4c.

Кроме биологического смысла репликации ученые нашли применение процесса в различных сферах медицины и науки. Если в биологии репликация - это удвоение ДНК, то в лабораторных условиях размножение молекул нуклеиновой кислоты используется для создания нескольких тысяч копий.

Такой метод получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР). Механизм этого процесса схож с репликацией in vivo, поэтому для его протекания применяются аналогичные ферменты и буферные системы.

Выводы

Репликация имеет важное биологическое значение для живых организмов. Передача при делении клеток не обходится без удвоения молекул ДНК, поэтому на всех этапах важна слаженная работа ферментов.

Репликация ДНК - процесс биосинтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты. Материалом для является аденозин-, гуанозин- цитидин- и тимидинтрифосфорная кислота или АТФ, ГТФ, ЦТФ и ТТФ.

Механизм репликации ДНК

Биосинтез осуществляется при наличии так называемой «затравки» - некоторого количества однониточной трансформированной дезоксирибонуклеиновой кислоты и катализатора. В качестве катализатора выступает ДНК-полимераза. Данный фермент принимает участие в соединении нуклеотидных остатков. За одну минуту соединяется более 1000 нуклеотидных остатков. Нуклеотидные остатки в молекуле фрагмента дезоксирибонуклеиновой кислоты соединены между собой 3’, 5’-фосфодиэфирными связями. ДНК-полимераза катализирует присоединение остатков мононуклеотидов до свободного 3-гидроксильного конца трансформированной дезоксирибонуклеиновой кислоты. Сначала синтезируются небольшие части молекулы ДНК. Они поддаются действию ДНК-лигазы и образуют более долгие фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты. Оба фрагмента локализируются в Преобразованная дезоксирибонуклеиновая кислота используется как точка роста будущей молекулы ДНК и является также матрицей, на которой образуется антипараллельная цепь дезоксирибонуклеиновой кислоты, которая идентична трансформированной ДНК по строению и последовательности размещения нуклеотидных остатков. Репликация ДНК происходит во время интерфазы митотического Дезоксирибонуклеиновая кислота концентрируется в хромосомах и хроматине. После формирования односпиральной дезоксирибонуклеиновой кислоты образуется ее вторичная и третичная структуры. Две нити дезоксирибонуклеиновой кислоты соединяются между собой по правилу комплементарности. Репликация ДНК происходит в ядрах клеток.

Материалом для биосинтеза разных групп и видов РНК является макроэргические соединения: АТФ, ГТФ, ЦТФ и ТТФ. может синтезироваться в них при участии одного из трех указанных фрагментов: ДНК-зависимой РНК-полимеразы, полинуклеотид-нуклеотидилтрансферазы и РНК-зависимой РНК-полимеразы. Первая из них содержится в ядрах всех клеток, открытая также в митохондриях. РНК синтезируется на ДНК-матрице при наличии рибонуклеозидтрифосфатов, ионов Мангана и Магния. Образуется молекула РНК, комплементарная ДНК-матрице. Для того, чтобы произошла репликация ДНК в ядрах образуются р-РНК-, т-РНК-, и-РНК- и РНК-затравки. Первые три транспортируются в цитоплазму, где и принимают участие в биосинтезе белка.

Репликация ДНК происходит почти также как и трансляция дезоксирибонуклеиновой кислоты. Передача, а также сохранение наследственной информации осуществляется в два этапа: транскрипция и трансляция. Что же такое ген? Ген - это материальная единица, которая является частью молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (РНК у некоторых вирусов). Содержится в хромосомах ядер клеток. Генетическая информация передается от ДНК через РНК до белка. Транскрипция осуществляется в и состоит в синтезе и-РНК на участках молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты. Следует сказать, что последовательность нуклеотидов дезоксирибонуклеиновой кислоты «переписывается» в нуклеотидную последовательность молекулы и-РНК. РНК-полимераза присоединяется к соответствующему участку ДНК, «расплетает» ее двойную спираль и копирует структуру дезоксирибонуклеиновой кислоты, присоединяя нуклеотиды по принципу комплементарности. По мере перемещения фрагмента цепь синтезированной РНК отдаляется от матрицы, а двойная спираль ДНК позади фермента сразу же восстанавливается. Если РНК-полимераза достигает конца копированного участка, РНК отдаляется от матрицы в кариоплазму, после чего перемещается в цитоплазму, где и принимает участие в биосинтезе белка.

Во время трансляции последовательность размещения нуклеотидов в молекуле и-РНК переводится в последовательность аминокислотных остатков в белковой молекуле. Этот процесс происходит в цитоплазме, и-РНК здесь объединяется, и образуется полисома.

Основное функциональное значение процесса репликации ДНК заключается в снабжении потомства генетической информацией. Для обеспечения генетической стабильности организма и вида ДНК должна реплицироваться полностью и с очень высокой точностью. Процесс репликации ДНК весьма сложен. В нем участвует множество ферментов. Первое энзимологическое исследование репликации ДНК было проведено Артуром Корнбергом, открывшим в Escherichia coli фермент, ныне называемый ДНК-полимеразой I. Этот фермент проявляет несколько типов ферментативной активности и характеризуется сложной структурой. В качестве субстратов ДНК-полимераза I использует дезоксирибонуклео-зидтрифосфаты-производные аденина, гуанина, цитозина и тимина. Полимеразная активность, впервые продемонстрированная для ДНК-полимеразы I, свойственна остальным полимеразам прокариотических и эукариотических клеток, при этом важно помнить, что основной функцией ДНК-полимеразы 1 Е. coli, как было установлено, является репарация ДНК.

Инициация синтеза ДНК

Для инициации синтеза ДНК (рис. 38.13) требуются короткие (10-200 нуклеотидов) последовательности РНК, выполняющие функции затравок (праймеров). Синтез начинается с реакции между 3-гидроксильной группой РНК-затравки и а-фосфатной группой дезоксирибонуклеозидтрифосфата, в ходе которой дезоксирибонуклеозидный остаток присоединяется к РНК-затравке с одновременным выщеплением пирофосфата. З-гидроксильная группа присоединенного дезоксирибону-клеозидмонофосфата осуществляет далее нуклеофильную атаку на а-фосфатную группу следующего встраивающегося дезоксирибонуклеозидтрифосфата, также с отщеплением пирофосфата. Естественно, что выбор очередного нуклеотида на каждом шаге синтеза определяется матричной цепью ДНК согласно правилам, предложенным впервые Уотсоном и Криком (рис. 38.14). Так, если в соответствующем положении матричной цепи находится остаток адениндезоксирибонуклеозидмонофосфата, то в реакцию будет вступать тимидинтрифосфат и его а-фосфатная группа будет атаковаться 3-гидроксильной группой последнего остатка растущей цепи. Реакция происходит только в том случае, если встраиваемый нуклеотид образует комплементарную пару с очередным нуклеотидом матричной цепи ДНК и благодаря водородным связям занимает положение, при котором З-гидроксильная группа растущей цепи атакует новый нуклеотид и включает его в полимер. Последовательности ДНК, присоединенные к РНК-затравкам, были названы по имени открывшего их японского ученого - фрагментами Оказаки (рис. 38.15). У млекопитающих после образования значительного числа фрагментов Оказаки репликационный комплекс приступает

(см. скан)

Рис. 38.13. Инициация синтеза ДНК РНК-затравкой и последующее присоединение второго дезоксирибонуклеозидтрифосфата.

Рис. 38.14. Матричная функция ДНК-цепи при инициированном РНК-затравкой синтезе комплементарной цепи.

Рис. 38.15. Прерывистая полимеризация дезоксирибонуклеотидов и образование фрагментов Оказаки.

к удалению РНК-затравок и заполнению образующихся брешей соответствующими дезоксирибо-нуклеотидами. Затем с помощью ДНК-лигазы фрагменты «сшиваются» между собой с образованием непрерывной цепи ДНК.

Полярность репликации

Как уже отмечалось, молекулы ДНК состоят из двух антипараллельных цепей. Репликация ДНК у про- и эукариот происходит одновременно на обеих цепях. Однако фермента, ведущего синтез ДНК в направлении , не существует, и, следовательно, вновь синтезируемые цепи, казалось бы, не могут расти в одном и том же направлении одновременно. Несмотря на это противоречие, один и тот же фермент осуществляет практически синхронный синтез обеих цепей. При этом цепь, синтезируемая в направлении 5-У («лидирующая»), оказывается непрерывной. Синтез второй («отстающей») цепи осуществляется фрагментами по 150-200 нуклеотидов. Очередные акты инициации синтеза этих фрагментов, происходящего в каждый данный момент также в направлении осуществляются по мере общего продвижения репликационной вилки в одном направлении. Схема «полунепрерывного» синтеза ДНК представлена на рис. 38.16.

При репликации ядерной ДНК млекопитающих

Рис. 38.16. Процесс полунепрерывной, одновременной репликации обеих цепей двухцепочечной ДНК.

большая часть РНК-праймеров в конце процесса удаляется, между тем при репликации митохондриального генома небольшие фрагменты РНК остаются интегрированными в замкнутой кольцевой молекуле ДНК.

Ферменты полимеризации и репарации ДНК

В ядрах клеток млекопитающих имеется класс полимераз, так называемых полимераз альфа (Pol а), ответственных за хромосомную репликацию. Одна молекула Pol а способна включать в растущую цепь около 100 нуклеотидов в секунду, таким образом она функционирует примерно в десять раз медленнее, чем бактериальная ДНК-полимераза. Снижение скорости может объясняться помехами со стороны нуклеосом. Как ДНК-полимераза преодолевает нуклеосомы - неизвестно. Однако известно, что после завершения репликации соответствующие нуклеосомы оказываются распределенными случайным образом в обеих дочерних цепях.

В ядрах клеток млекопитающих обнаружена также ДНК-полимераза с меньшей, нежели у Pol а, молекулярной массой-полимераза бета (Pol, которая не участвует в обычном процессе репликации, но необходима для репарации ДНК (см. ниже). Еще одна, митохондриальная, ДНК-полимераза гамма (Polу) осуществляет репликацию кольцевого генома митохондрий.

Полная репликация генома млекопитающих заканчивается за 9 часов-время, необходимое для удвоения генетического материала диплоидной делящейся клетки. Такая скорость свидетельствует о том, что репликация начинается сразу на многих участках, называемых точками начала репликации и обозначаемых ori (от англ. origin - начало). Таких точек (сайтов) насчитывается около 100. Репликация происходит в двух направлениях, и обе цепи реплицируются одновременно. При этом на хромосоме образуются так называемые «репликационные пузыри» (рис. 38.17).

Сайты, выполняющие роль точек начала репликации у эукариот, определены не достаточно четко. Более полные данные в этом плане имеются для дрожжей и нескольких вирусов животных. Можно сказать с уверенностью, что процессы инициации контролируются как в пространственном аспекте, так и во временном, поскольку соседние кластеры инициируются синхронно. Существует представление о том, что функциональные домены хроматина реплицируются как целостные единицы. При этом подразумевается, что точки начала репликации расположены вполне определенным образом по отношению к единицам транскрипции.

Рис. 38.17. Образование «репликационных пузырей» в процессе синтеза ДНК. Показаны двунаправленность репликации и предполагаемое расположение белков, расплетающих цепь, в репликационных вилках.

Рис. 38.18. Гипотетическая схема действия белка, специфичного к одноцепочечной ДНК в репликационной вилке. По мере синтеза второй цепи белок высвобождается и присоединяется к вновь образованным участкам одноцепочечной ДНК. (Courtesy of В. Alberts.)

(см. скан)

Рис. 38.19. Сравнение двух типов реакций, репарирующих одноцепочечные разрывы ДНК. Реакции, представленные слева, катализируются ДНК-лигазой, а представленные справа-ДНК-топоизомеразой. (Slightly modified and reproduced, with permission from Lehninger A. L.: Biochemistry, 2nd ed. Worth, 1975.)

При репликации двухцепочечная ДНК должна разойтись на индивидуальные цепи с тем, чтобы каждая из них могла функционировать в роли матрицы. Разделению цепей ДНК содействуют молекулы специфических белков, стабилизирующих одноцепочечную структуру при продвижении репликационной вилки. Стабилизирующие белки стехиометрически связываются с одиночной цепью, не мешая при этом нуклеотидам выступать в роли матрицы (рис. 38.18). Наряду с разделением цепей должно происходить и раскручивание спирали (1 оборот на каждые 10 нуклеотидов), сопровождаемое скручиванием вновь синтезированных дочерних цепей. Учитывая время, за которое происходит репликация у прокариот, можно рассчитать, что молекула ДНК должна раскручиваться со скоростью 400 000 об/сек, что совершенно невозможно. Следовательно, должны существовать множественные «шарниры», расположенные по всей длине молекулы ДНК. Шарнирные функции выполняет специальный фермент (ДНК-топоизомераза), вносящий разрывы в одну из цепей раскручиваемой двойной спирали. Разрывы быстро зашиваются этим же ферментом без дополнительных энергетических затрат, поскольку необходимая энергия запасается в форме макроэргической ковалентной связи, возникающей между сахарофосфатным остовом цепи ДНК и топоизомеразой. Представленную на рис. 38.19 схему этого процесса можно сравнить с последовательностью событий сшивания разрыва в ДНК, катализируемых ДНК-лигазой. ДНК-топоизомеразы ответственны также за раскручивание суперспирализованной ДНК. Суперспирализованная ДНК - это высокоупорядоченная структура, образуемая кольцевыми или сверх-длинными молекулами ДНК при закручивании вокруг гистонового кора (рис. 38.20).

Один из классов вирусов животных (ретровирусы) обладает ферментами, способными синтезировать молекулу ДНК по матрице РНК. РНК-зависимая ДНК-полимераза, или обратная транскриптаза (таково название этого фермента), сначала синтезирует РНК-ДНК-гибрид, используя рибонуклеиновый геном вируса в качестве матрицы. Затем фермент РНКаза Н удаляет РНК-цепь, а оставшаяся ДНК-цепь в свою очередь служит матрицей для синтеза второй цепи ДНК. Таким образом возникает кДНК-двухцепочечная ДНК-копия, содержащая информацию, первично представленную в виде РНК-генома ретровируса.

Регуляция синтеза ДНК

В клетках животных и человека репликация ДНК происходит только в определенный период жизни клетки. Этот период называется синтетическим (так называемая -фаза). -фаза отделена от митоза предсинтетическим и постсинтетическим периодами (рис. 38.21).

Рис. 38.20. Суперскручивание ДНК. Левозакрученная тороидная (соленоидная) сверхспираль (слева) превращается в правозакрученную при удалении цилиндрического ядра. Аналогичный переход происходит при разрушении нуклеосом в случае экстракции гистонов концентрированными солевыми растворами.

Первичная регуляция клеткой синтеза собственной ДНК заключается в том, что репликация происходит в строго определенное время и в основном в клетках, готовящихся к делению. В регуляции вступления клетки в -фазу участвуют циклические пуриновые нуклеотиды и, возможно, сами субстраты синтеза ДНК. Механизм такой регуляции остается неизвестным. Многие онковирусы способны ослаблять или разрушать внутренние информационные связи, контролирующие вступление клеток в -фазу. И в этом случае механизм остается неясен, хотя, возможно, он включает фо-сфорилирование определенных белковых молекул хозяйской клетки.

В -фазе клетки млекопитающих содержат большее количество полимеразы а, чем в несинтетические периоды клеточного цикла. Кроме того, в -фазе усиливается активность ферментов, участвующих в образовании субстратов синтеза ДНК (дезок-сирибонуклеозидтрифосфатов). Активность этих ферментов падает при выходе из -фазы и остается на низком уровне вплоть до поступления сигнала к возобновлению синтеза ДНК. В -фазе происходит полная и строго однократная репликация ядерной ДНК. Создается впечатление, что реплицированный хроматин каким-то образов маркируется, в результате

Рис. 38.21. Цикл деления клеток млекопитающих. Фаза синтеза ДНК (-фаза) отделена от митоза периодами G, и G,. (Стрелкой указано направление цикла клеточного развития.)

чего создаются помехи для дальнейшей репликации до тех пор, пока клетка не пройдет митоз. Можно предположить, что в качестве такого ковалентного маркера выступают метильные группы (т.е. маркирование ДНК осуществляется за счет ее метилирования).

Как правило, каждая данная пара хромосом реплицируется одновременно и в строго определенный промежуток S-фазы. Природа сигналов, регулирующих синтез ДНК на этом уровне, неизвестна, но, по-видимому, таким механизмом регуляции обладает каждая индивидуальная хромосома.

Деградация и репарация ДНК

Передача наследственной информации в неискаженном виде - важнейшее условие выживания как каждого конкретного организма, так и вида в целом. Следовательно, в ходе эволюции должна была сформироваться система, позволяющая клетке исправлять нарушения ДНК, вызванные ошибками репликации или повреждающими воздействиями окружающей среды. Подсчитано, что в результате повреждений, обусловленных этими причинами, в геноме клеток зародышевой линии человека происходит в среднем шесть нуклеотидных замен в год. По-видимому, в соматических клетках за год происходит примерно такое же число мутаций.

Как описано в гл. 37, основным условием точной репликации является правильное образование пар нуклеотидов. Точность комплементарных взаимодействий зависит от того, находятся ли пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды в благоприятной для спаривания таутомерной форме (рис. 34.7). В равновесии концентрация благоприятных таутомерных форм нуклеотидов превышает концентрацию неблагоприятных таутомеров в 104-105 раз. Этого явно недостаточно для обеспечения безошибочного узнавания. Вот почему в клетках бактерий и млекопитающих существует специальная система мониторинга точности спаривания нуклеотидов. Этот этап проверяется дважды: первый раз - при включении дезоксирибонуклеозидтрифосфатов в растущую цепь и второй раз - уже после включения, с использованием энергозависимого механизма удаления ошибочно встроенных нуклеотидов из вновь синтезированной нити ДНК. Благодаря такому контролю ошибки включения происходят не чаще чем 1 раз на 108-10е пар оснований. В клетках Е. coli этот механизм обеспечивается ДНК-полимеразой, обладающей активностью. В то же время ДНК-полимеразы млекопитающих не обладают явно выраженной корректирующей нуклеазной активностью.

Физические и химические факторы окружающей среды вызывают в ДНК повреждения четырех типов (см. табл. 38.2). Поврежденные участки могут быть подвергнуты репарации, замещены путем рекомбинации или остаться без изменений. В последнем случае возникают мутации, потенциально ведущие к гибели клетки. Возможность репарации и замещения базируется на избыточности информации закодированной в структуре двухспиральной ДНК: дефектная область одной цепи ДНК может быть исправлена по неповрежденной комплементарной цепи.

Ключевой момент всех рекомбинационных и репарационных событий - распознавание дефекта, сопровождающееся либо непосредственной репарацией, либо маркированием для последующего исправления. Термолабильность N-гликозидной связи пуринов приводит к депуринизации ДНК с частотой около 5000-10000 на клетку (в день) при 37° С. Места депуринизации узнаются специальными ферментами,

Таблица 38.2. Типы повреждений ДНК

специфически заполняющими брешь без разрыва фосфодиэфирного остова молекулы.

Как цитозиновые, так и адениновые основания спонтанно дезаминируются с образованием урацила и гипоксантина соответственно. Поскольку в норме ДНК не содержит ни урацила, ни гипоксантина, нет ничего удивительного в том, что специфические -гликозилазы узнают эти аномальные основания и удаляют их. Образовавшийся разрыв служит сигналом для действия репарационных пурин- или пиримидинспецифичных эндонуклеаз, расщепляющих фосфодиэфирную связь возле соответствующего участка повреждения. После этого при последовательном действии экзонуклеазы, репарационной ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы происходит заполнение бреши и восстановление исходной правильной структуры (рис. 38.22). Эта цепь событий получила название эксцизионной репарации. Сходным образом происходит процесс репарации ДНК, содержащей алкилированные основания и аналоги оснований.

Восстановление делеций и удаление вставок происходит при помощи рекомбинационных процессов, которые могут протекать либо с участием репликации, либо без нее.

Ультрафиолетовое излучение индуцирует образование пиримидин-пиримидиновых димеров.

Рис. 38.22. Фермент урацил-ДНК-гликозилаза удаляет урацил, возникающий при спонтанном дезаминировании цитозина. (Courtesy of В. Alberts.)

Рис. 38.23. Тимин-тиминовый димер, образующийся при связывании рядом расположенных тиминовых оснований.

Этот процесс затрагивает преимущественно расположенные друг под другом тиминовые основания одной цепи (рис. 38.23). Для удаления тиминовых димеров в клетке существуют два механизма: эксцизионная репарация и фотореактивация. Этот способ репарации подразумевает фотоактивацию видимым светом специфического фермента, который обращает процесс, приведший к образованию димерной структуры.

Одноцепочечные разрывы ДНК, вызванные ионизирующей радиацией, могут быть репарированы прямым лигированием или рекомбинацией. Механизмы, вовлеченные в репарацию поперечных сшивок между основаниями противолежащих цепей или между ДНК и белками, изучены недостаточно.

Итак, репарация повреждений, вызванных ионизирующей радиацией и алкилированием оснований, осуществляется путем вырезания и ресинтеза коротких участков ДНК. Удаление повреждений, вызванных ультрафиолетовым облучением, а также поперечных сшивок достигается аналогичным путем, но в этом случае затрагиваются более протяженные участки ДНК. В клетках млекопитающих о протекании репарационной репликации свидетельствует внеплановый синтез ДНК, т.е. включение в ДНК радиоактивных предшественников вне S-фазы.

При интенсификации процессов эксцизионной репарации в ответ на повреждающие воздействия в клетках млекопитающих усиливается активность фермента поли(АОР-рибозил)-полимеразы. Этот фермент при участии кофермента осуществляет реакцию ADP-рибозилирования белков хроматина. В основном происходит моно-ADP-рибозилирование, однако иногда имеет место присоединение гомополимерных цепочек (ADP-рибоза). Функция поли(АОР-рибозил)-полимеразы или ее продукта - (ADP-рибоза), - в процессе эксцизионной репарации не вполне ясна. Наблюдается корреляция во времени между интенсификацией

процессов репарации и увеличением активности фермента. Специфическое ингибирование активности данного фермента препятствует устранению разрывов в цепи ДНК. Увеличение активности poly (ADP-рибозил)полимеразы вызывается, по-видимому, фрагментацией ДНК в ядре. Такая фрагментация может быть индуцирована в первую очередь физическими агентами (например, рентгеновским излучением), кроме того, она может происходить неадекватно интенсивно в ходе репарации ультрафиолетовых повреждений или повреждений, вызванных алкилирующими агентами. Возрастание активности фермента, вызванное разрывами ДНК, бывает настолько велико, что может привести к истощению внутриклеточного запаса кофермента NAD+.

Пигментная ксеродерма-аутосомно-рецессивное наследственное заболевание. Клинический синдром включает чувствительность к солнечному свету (ультрафиолет), что приводит к образованию множества очагов рака кожи и летальному исходу. Это заболевание, по-видимому, связано с нарушениями репарационных процессов. В культивируемых клетках больных пигментной ксеродермой снижена интенсивность фотореактивации тиминовых димеров. Однако собственно генетические нарушения, приводящие к пигментной ксеродерме, насчитывают по меньшей мере 7 комплементационных групп, что указывает на комплексность причин, вызывающих данное заболевание.

При пигментной юсеродерме в клетках большинства (если не всех) комплементационных групп наблюдаются аномалии в скорости и интенсивности ответа поли(АОР-рибозил)-полимеразы на ультрафиолетовое облучение. В клетках по крайней мере одной комплементационной группы снижение активности фермента, по-видимому, связано с неспособностью разрезать цепь ДНК у поврежденного сайта, поскольку добавление к таким дефектным клеткам дезоксирибонуклеазы нормализует уровень активности поли(АОР-рибозил)-полимеразы.

У больных с атаксией - телеангиэктазией (аутосом-но-рецессивное заболевание, приводящее к мозжечковой атаксии и лимфоретикулярной неоплазме) повышена чувствительность к рентгеновскому облучению. У больных анемией Фанкони (аутосомно-рецессивная анемия, сопровождающаяся повышенной частотой онкологических заболеваний и хромосомной нестабильностью), вероятно, нарушена система репарации поперечных сшивок. Для всех трех описанных синдромов характерна повышенная частота возникновения опухолей. Вполне возможно, что в недалеком будущем будут выявлены другие заболевания человека, вызванные нарушениями в системе репарации повреждений ДНК.

ЛИТЕРАТУРА

Bauer W. R. et al. Supercoiled DNA, Sci. Am. (July), 1980, 243, 118.

Cantor C.R. DNA choreography, Cell, 1981, 25, 293. Igo-Kemenes Т., Horz W., Zachau H.G. Chromatin, Annu.

Rev. Biochem., 1982, 51, 89.

Jelinek W. R.. Schmid C. W. Repetitive sequences in eukaryotic DNA and their expression, Annu. Rev. Biochem., 1982,51, 813.

Jongstra J. et al. Induction of altered chromatin structures by simian virus 40 enhancer and promoter elements, Nature, 1984, 307, 708.

Kornberg A. DNA Replication, Freeman, 1980.

Lindahl T. DNA repair enzymes, Annu. Rev. Biochem., 1982, 51, 61.

Loeb L. A., Kunkel T. A. Fidelity of DNA synthesis, Annu. Rev.

Biochem, 1982, 51, 429.

McGhee J. D., Felsenfeld G. Nucleosome structure, Annu. Rev.

Biochem., 1980, 49, 1115.

Nossal N. G. Prokaryotic DNA replication systems, Annu. Rev. Biochem., 1983, 52, 581.

Информация, записанная в ДНК, должна быть не только реализована в процессе развития клеток и организмов, но и в полном объеме передана следующему поколению. С этой целью перед делением клетки в ней осуществляется процесс репликации , т.е. удвоения количества ДНК.

Информация о механизме репликации содержится в самой ДНК: одни гены кодируют ферменты, синтезирующие предшественники ДНК — нуклеотиды, другие — ферменты, обеспечивающие соединение активированных нуклеотидов в единую цепочку. Механизм репликации был впервые постулирован Дж. Уотсоном и Ф. Криком, которые отмечали, что комплементарность цепей ДНК наводит на мысль, что эта молекула может удваивать саму себя. Они предположили, что для удвоения необходим разрыв водородных связей и расхождение цепей, каждая из которых играет роль матрицы при синтезе комплементарной цепи. В результате одного акта удвоения образуются две двунитиевые молекулы ДНК, в каждой из которых имеется одна материнская нить и одна новая (см. рис.).

Механизм получил название полуконсервативной репликации . Позже матричная природа и постулированный принцип репликации ДНК были подтверждены многочисленными экспериментальными данными.

Репликация ДНК начинается в специфических точках хромосомы — сайтах инициации репликации (origin). Процесс репликации обслуживается большим количеством ферментов. Наиболее полно изучен аппарат репликации бактериальной ДНК, особенно E. coli. Функцию расплетания молекулы ДНК у прокариот выполняют специфические ферменты геликазы , которые используют для работы энергию гидролиза АТФ до АДФ. Они часто функционируют в составе белкового комплекса, осуществляющего перемещение вилки и репликацию расплетенных нитей. Удерживают нити ДНК от воссоединения другие специфические белки, связывающиеся с одноцепочечными участками. Эти участки, разошедшиеся в разные стороны, образуют характерную структуру — репликативную вилку (вилку Кернса). Это — та часть молекулы ДНК, в которой в данный момент осуществляется синтез новой цепи. В продвижении вилки большую роль играет белок гираза , относящийся к разряду топологических изомераз. Он обнаружен только у бактерий. Гираза — это релаксирующий фермент, который, производя двунитиевые разрывы, снимает положительные (перед вилкой) и способствует образованию отрицательных (сзади вилки) супервитков в релаксированной ДНК.

Каждая цепь материнской ДНК служит матрицей для синтеза дочерних молекул. На одной цепи синтез осуществляется непрерывно в направлении от 5" к 3" концу. Эта цепь называется лидирующей. Вторая цепь с противоположной направленностью, называемая отстающей, синтезируется в виде отдельных фрагментов, которые затем сшиваются лигазами в непрерывную молекулу. Фрагменты названы по имени американского ученого Р. Оказаки, впервые постулировавшего такой способ синтеза ДНК, фрагментами Оказаки . В ходе синтеза репликативная вилка перемещается вдоль матрицы, и при этом новые участки ДНК последовательно расплетаются до тех пор, пока вилка не дойдет до точки окончания синтеза (точка терминации).

Синтез новой цепи ДНК требует затравки в виде небольшого фрагмента РНК, т.к. ведущий его фермент ДНК-полимераза для работы нуждается в свободной 3"OH группе. У прокариот обнаружены три разных ДНК-полимеразы с аналогичными функциями, обозначаемые как polI, polII и polIII. Наиболее полно изучена ДНК-полимераза I. Она представляет собой одиночный полипептид с мультифункциональной активностью (полимеразной, 3" → 5" экзонуклеазной и 5" → 3" экзонуклеазной). Синтез затравки (праймера) осуществляет фермент праймаза, который иногда входит в состав комплекса — праймосомы из 15-20 белков, активирующих матрицу. Затравка состоит из 10-60 рибонуклеотидов. После того как ключевой фермент синтеза ДНК у E. coli — polIII — присоединяет к затравке первые дезоксирибонуклеотиды, она удаляется с помощью polI, обладающей 3" → 5" экзонуклеазной активностью, т.е. способностью отщеплять концевые нуклеотиды с 3"-конца цепи. Затравка синтезируется также и в отстающей цепи в начале каждого фрагмента Оказаки. Ее отщепление, а также удлинение фрагментов, синтезированных polIII, осуществляет polI. Роль polII в репликации ДНК E. coli до сих пор не совсем ясна.

При репликации ДНК эукариот процесс репликации осложняется присутствием в составе хромосом белков. Чтобы расплести ДНК, необходимо разрушить сильно конденсированный комплекс ДНК и гистонов, а после репликации вновь осуществить компактизацию дочерних молекул. Раскручивание ДНК вызывает суперспирализацию участков, расположенных рядом с репликационной вилкой. Для снятия возникающего напряжения и свободного продвижения вилки здесь работают специфические ферменты релаксации — топоизомеразы . В различных организмах идентифицированы два типа топоизомераз: I и II типов. Они изменяют степень сверхспирализации и тип сверхспирали, производя разрывы в одной (топоизомеразы I типа) или обеих цепях ДНК (топоизомеразы II типа), и устраняют риск спутывания нитей ДНК.

Репликация бактериальной ДНК является двунаправленным процессом с одним сайтом инициации. В отличие от этого хромосома эукариот состоит из отдельных участков репликации — репликонов и имеет много сайтов инициации. Репликоны могут реплицироваться в разное время и с разной скоростью. Скорость репликации ДНК в эукариотических клетках значительно ниже, чем в прокариотических. У E. coli скорость приблизительно равна 1500 п.н. в секунду, у эукариот — 10-100 п.н. в секунду. Двуцепочечные кольцевые ДНК некоторых вирусов реплицируются по типу катящегося кольца. В этом случае одна цепь ДНК надрезается в одном месте специфическим ферментом и к образовавшемуся свободному 3"ОН-концу с помощью фермента polIII начинают присоединяться нуклеотиды. Матрицей служит внутренняя кольцевая молекула. Надрезанная цепь при этом вытесняется, а затем удваивается по типу отстающей цепи E. coli с образованием фрагментов, которые сшиваются лигазами.